嗜热链球菌grx02 化学限定增殖培养基及变温培养策略的研究

彭奎耀，关成冉，瓦云超，顾瑞霞

(扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州 225000）

0 引 言

嗜热链球菌作为发酵剂，具有快速产酸凝乳和改善产品质构的特征，被广泛用于乳制品的发酵[1]。早在二十世纪初，人们利用嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种作为发酵剂菌株生产酸奶[2]。在发酵过程中，嗜热链球菌可以产生许多功能性物质，如胞外多糖、细菌素和维生素等，在降胆固醇、抗氧化、保护肝损伤、抑制肠道致病菌及抗炎症等方面具有开发利用的潜力[3-7]。由此可见，嗜热链球菌市场需求巨大，商业价值高。

目前用于培养嗜热链球菌的培养基多采用M RS、M 17 等，这些商用培养基来源不同，培养效果重复性差，会造成批次间差异。此外，商用培养基中含有蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物等复杂成分[8]，在代谢组学和蛋白质组学研究中，会对特定营养素或选定分子的监测带来问题[9-10]。化学限定培养基（chemically defined m edium,CDM）是一种营养均衡且化学成分已知的培养基，通常包含碳源、氮源、无机盐及目标微生物所需的其他营养物质，具有良好的培养重复性[11-12]。CDM 可排除未知成分的干扰，更准确有效的用于嗜热链球菌代谢途径、基因调控与蛋白质表达的研究[13-14]。但利用化学限定培养基培养嗜热链球菌获得的最大生物量较低，限制其在嗜热链球菌规模化培养中的应用。

研究表明，温度是影响乳酸菌生长的重要因素[15-16]。大部分研究都是关于单一培养温度对乳酸菌生长的影响，如ARmin T[17]探究温度对8 株嗜热链球菌生长的影响，发现37 ℃更适合嗜热链球菌生长。仅有少部分研究变温培养对乳酸菌生长的影响。冯镇[18]发现与单一温度培养相比，适合变温培养能够提高乳酸乳球菌的生物量与发酵活力。目前，未发现关于嗜热链球菌变温培养的研究。

本文优化获得嗜热链球菌grx02 增殖的化学限定培养基及变温培养条件，为嗜热链球菌生产及其代谢与功能研究提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

嗜热链球菌grx02 为扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离、筛选和保存的专利菌株。

1.1.2 试剂

乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化镁、氯化钙、乙酸钠、柠檬酸铵、尿素、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、抗坏血酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；盐酸硫胺素、泛酸钙、叶酸、生物素、烟酸、盐酸吡哆醇、对氨基苯甲酸、核黄素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、缬氨酸，均为分析纯，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

全自动高压蒸汽灭菌锅，TOM Y 公司；DNP-9272 恒温培养箱、HZP-150 恒温摇床培养箱，上海精宏实验设备有限公司；FP-110-C Bioscreen CTM 系统，Lab-system s 公司；101-1BS 恒温鼓风干燥箱，力辰科技有限公司。

1.2 菌体生长曲线的绘制

Bioscreen C 系统可自动化进行测定并记录菌体生长情况，该系统内置的EZ Experim ent 软件能够持续地记录菌体密度。本实验参数设置：相应培养温度，培养时间24 h，测量间隔30 min，波长600 nm，测量前后震荡时间30 s，震荡完成静止10 s 读值。

每个加样孔中加入294 m L 培养基与6 m L 二代菌悬液后混匀，将样品板放入Bioscreen C 培养箱内，每组样品设置3 个平行，培养24 h 后记录数据。

1.3 活菌数的测定

活菌数的测定采用平板计数法。

1.4 化学限定培养基的配制

预先配制46 种组分的浓缩液，成分及浓度如表1，按照浓缩比例再进一步配制各组分的预混液。采用121 ℃灭菌15 min。

表1 化学限定培养基配方

1.5 必需营养成分的确定

根据表1 所示，逐个缺失每一种因素（乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖除外），绘制生长曲线，确定菌体生长的必需营养成分，从而精简CDM 成分。乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖分别进行单因素实验，确定菌株的最佳碳源及浓度。

1.6 CDM 成分浓度优化实验

CDM 中每种因素的含量设置5 个水平，选取范围如表2 所示。

表2 化学限定培养基组分以及单因素营养素水平选取

1.7 不同温度培养

将菌体接种于CDM 中，培养温度为42、39、37 ℃和35 ℃，利用全自动生长曲线仪绘制生长曲线，并在对数末期计活菌数，测定发酵pH 值。每组实验设3 个平行，重复2 次。

1.8 变温培养策略

将菌体接种于CDM 中，初始温度39 ℃培养，延滞期末期培养温度分别为42 、39 ℃和37 ℃，对数末期培养温度分别为42 、39 ℃和37 ℃。测定菌体生长曲线，对数末期活菌数，发酵pH 值，每组实验设3 个平行，重复2 次。

1.9 数据统计与分析

使用软件O rigin 2018 绘图，Excel 2010 和SPSS 19.0 进行数据处理，数据通过单因素方差分析（ANOVA）统计，检验结果取平均值（P<0.05）作为统计学差异判断标准。

2 结果与讨论

2.1 嗜热链球菌grx02 的CDM 碳源及其浓度的确定

为研究碳源对嗜热链球菌grx02 生长的影响，在预配制的CDM 中，分别添加1%浓度的乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖及半乳糖，测定对数期末期OD600、计算生长速率，结果如图1(a)所示。

图1 碳源及乳糖浓度对嗜热链球菌grx02 生长的影响

由图1(a)可知，嗜热链球菌grx02 在CDM-Lac中生物量和生长速率最优，分别为每小时0.862、0.105，在CDM-Gal 中生长最差，生物量仅为0.220，表明乳糖为嗜热链球菌grx02 生长最适碳源。进一步研究乳糖浓度对嗜热链球菌grx02 生长的影响如图1（b）所示，随乳糖浓度的升高，嗜热链球菌grx02 的生物量和生长速率呈先增长后降低的趋势，在乳糖浓度为2%时达最大值，分别为每小时0.910、0.112 ，表明嗜热链球菌grx02 生长最适的乳糖浓度为2%。在LIU G F[19]的研究中也发现乳糖最适合嗜热链球菌的生长。

2.2 CDM 必需营养成分的确定

2.2.1 矿物质成分的确定

矿物元素是微生物生长和代谢产物合成的重要影响因子，如M g2+参与许多酶促反应，影响核苷酸等的代谢[20-22]，M n2+能够缓解氧气对菌体的毒副作用[23]，Ca2+可以促使ADP 磷酸化为ATP，为微生物细胞的增殖代谢提供能量并促进菌株的生长[24]。通过单一扣除矿物元素，确定嗜热链球菌grx02 生长需要的矿物质，结果如图2 所示。

图2 单一缺失矿物质对嗜热链球菌grx02 生长的影响

与对照组相比，缺少M n2+、M g2+时，嗜热链球菌grx02 基本没有生长（生物量＜0.1）；缺少Ca2+时，生物量明显降低，Zn2+的缺少对生物量没有显著变化；而缺少Fe2+时，生物量明显升高，表明M n2+、M g2+是嗜热链球菌grx02 生长必需矿物质，Ca2+促进菌体生长，Fe2+抑制菌体生长。因此，选取M n2+、M g2+及Ca2+作为嗜热链球菌grx02 生长CDM 中的矿物质成分。

2.2.2 维生素成分的确定

在菌体生长过程中，B 族维生素作为辅助因子或辅酶在碳水化合物、蛋白质及核酸的代谢中具有至关重要的地位，如核黄素、烟酸在菌体的代谢过程中参与辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的合成，作用于胞内的许多生物氧化反应[25-26]。本实验通过单一缺失维生素，确定嗜热链球菌grx02 生长需要的维生素，结果如图3 所示。

图3 单一缺失维生素对嗜热链球菌grx02 生长的影响

与对照组相比，缺少泛酸钙、烟酸时嗜热链球菌grx02 基本没有生长（生物量＜0.1）；缺少盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、抗坏血酸时，嗜热链球菌grx02 生长生物量降低；而对氨基苯甲酸、叶酸的缺少对于嗜热链球菌grx02 生物量没有显著影响。结果表明：泛酸钙、核黄素及烟酸是嗜热链球菌嗜热链球菌grx02 生长必需营养成分，盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、抗坏血酸有促进菌体生长的作用，对氨基苯甲酸、叶酸对于菌体生长是非必要成分。因此，选取泛酸钙、核黄素、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、抗坏血酸作为嗜热链球菌grx02生长CDM 中的维生素成分。

2.2.3 氨基酸成分的确定

嗜热链球菌是营养需求型菌株，需要氨基酸来维持最佳生长。如GARAU LT P C[27]发现亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸是嗜热链球菌必需氨基酸。因此，本实验通过单个缺失氨基酸，确定嗜热链球菌grx02 生长需要的氨基酸，结果如图4 所示。

图4 单一缺失氨基酸对嗜热链球菌grx02 生长的影响

在缺少谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸及缬氨酸时，嗜热链球菌grx02 基本不生长（生物量＜0.1），是嗜热链球菌grx02 必需营养素。异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺扣除后，生物量均减少。分别扣除丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺时，生物量没有明显地变化，但延长了菌体生长延滞期，导致菌体生长速率的下降。当酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸缺乏时，菌体浓度高于对照组，表明嗜热链球菌grx02 生长不需要这些氨基酸。因此，选取谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸及谷氨酰胺作为嗜热链球菌grx02 生长CDM 中的氨基酸成分。

2.2.4 其他必需成分的确定

在嗜热链球菌生长过程中还需要其他营养物质，如无机盐、无机氮源等。通过单一扣除实验，确定嗜热链球菌grx02 生长需要的矿物质成分，结果如图5 所示。

图5 单一缺失其他营养物质对嗜热链球菌grx02 生长的影响

与对照组相比，尿素和柠檬酸铵被扣除后，嗜热链球菌grx02 基本没有生长（生物量＜0.1），是嗜热链球菌grx02 必需营养素。因为尿素和柠檬酸铵为嗜热链球菌grx02 提供氮源。缺少乙酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，菌体生物量均有减少，表明这些成分是嗜热链球菌grx02 生长所需的。

2.3 CDM 成分浓度优化

为了进一步研究除碳源以外其他营养物质对嗜热链球菌grx02 生长的影响，将32 种营养成分设置5个浓度梯度，测定对数期末期OD600，结果如表3 所示。

表3 营养成分浓度对嗜热链球菌grx02 生长的影响

根据表3 结果，将32 种营养物质分为3 类：第一类，随着营养物质浓度的升高，菌体浓度先显著升高后显著降低，包括K2HPO4、KH2PO4、N a2HPO4、N aH2PO4、尿素、乙酸钠、烟酸、抗坏血酸、核黄素、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸共16 种成分，确定各物质添加量分别为3、3、4.25、3.59、0.72、2、0.0025、1，0.0025、1.21、1.46、1.19、1.31、1.49、1.31、1.33 g/L。第二类，随着成分浓度升高，菌体浓度先显著升高后不变，包括组氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、盐酸吡哆醛、硫酸锰、柠檬酸铵共8 种成分，确定各物质添加量分别为0.75、0.73、0.825、0.445、1.02、0.0125、0.056、0.6 g/L。第三类，浓度升高，菌体浓度一直不变，包括缬氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、盐酸硫胺素、泛酸钙、硫酸镁、氯化钙共8 种成分，添加物质浓度为0.117、0.174、0.147、0.150、0.001、0.001、0.2、0.05 g/L。

2.4 温度对菌体生长的影响

2.4.1 单一温度培养研究

为研究温度对嗜热链球菌grx02 生长的影响，将嗜热链球菌grx02 接入优化后CDM 培养基中，分别在35、37、39 和42 ℃培养，测定生长曲线、pH 变化曲线及对数末期活菌数，结果如图6 所示。

由图6（a）可知，当嗜热链球菌grx02 在不同温度下培养时，其到达稳定期的时间在8 ~12 h，其中42 ℃培养时，嗜热链球菌grx02 能够更快的进入稳定期，但最终的生物量是39 ℃最高。图6(b)也表明相同的结果，嗜热链球菌grx02 在39 ℃下培养，活菌数最高为8.92 log CFU/m L。嗜热链球菌grx02 在42 ℃培养时，嗜热链球菌grx02 能够快速产酸，发酵液pH 下降最快。

单一温度培养时，嗜热链球菌grx02 在39 ℃培养时，活菌数最高，而42 ℃培养时，发酵液pH 下降最快。这也表明在嗜热链球菌grx02 发酵中，单一温度培养不能满足菌株更好的生长。为了获得高活菌数、高活力的菌体，分别在延滞期末期与对数期末期改变培养温度，以提高嗜热链球菌grx02 活菌数和菌活力。

2.4.2 变温培养研究

2.4.2.1 延滞期末期变温培养

为研究延滞期末期变温培养对嗜热链球菌grx02生长的影响，将39 ℃作为起始培养温度，延滞期末期变温为37、42 ℃。测定生长曲线、pH 变化曲线及对数末期活菌数，结果如图7 所示。

图7 延滞期末期变温培养对嗜热链球菌grx02 生长及pH 的影响

由图7 可知，延滞期末期改变培养温度分别为37、39 、42 ℃时，进入稳定期的培养时间有明显差异，分别是10.5 、9.5 、8.5 h，表明变温培养能够有效的改变菌体的生长周期，且转变较高温度培养，能够缩短培养周期，但不利于生物量的积累，相反37 ℃培养更有利于生物量的积累，活菌数显著高于其他2 组，为8.99 log CFU/m L。根据pH 变化曲线可知，与其它2组相比，37 ℃变温培养的pH 下降速率最快，表明其有助于提高嗜热链球菌grx02 的发酵活力，活菌数与发酵活力呈正相关。因此，延滞期末期变温至37 ℃培养更有利于嗜热链球菌grx02 的生长。

2.4.2.2 对数期末期变温培养

为研究对数期末期变温培养对嗜热链球菌grx02生长的影响，将39 ℃作为起始培养温度，延滞期末期变温为37 ℃，对数期末期分别变温为39 ℃、42 ℃。测定生长曲线、pH 变化曲线及对数末期活菌数，结果如图8 所示。

图8 对数期末期变温培养对嗜热链球菌grx02 生长及pH 的影响

由图8 可知，对照组进入对数末期后，菌体生长速率逐渐减少，而实验组均出现不同程度的跃升，实验组菌体密度均有所增加，实验组的活菌数均高于对照组，其中对数末期变温至39 ℃培养活菌数最高，为9.04 log CFU/m L。然而由pH 变化曲线可知，对数末期变温培养对pH 变化没有显著的影响。

综上，嗜热链球菌grx02 最优变温培养策略是：初始温度39 ℃，延滞末期改变培养温度为37 ℃，到达对数末期时变温为39 ℃，能够显著提高嗜热链球菌grx02 活菌数及发酵活力。冯镇等[18]在研究变温对嗜热链球菌生长时，也得到了相似的结果。

3 结 论

本研究通过对CDM 成分及浓度的优化，确定了能够促进嗜热链球菌grx02 增殖的CDM，包括：1 种碳源、16 种氨基酸、6 种维生素、3 种矿物质、4 种无机盐、2 种有机盐。又进一步研究温度对嗜热链球菌grx02 生长的影响，发现采用初始温度39 ℃，延滞末期改变培养温度为37 ℃，到达对数末期时变温为39 ℃的培养方式，能够显著提高嗜热链球菌grx02 生物量。优化前嗜热链球菌grx02 生物量达到0.862，通过对化学限定培养基的成分、浓度及菌株培养温度策略的优化，嗜热链球菌grx02 生物量达到1.40，较优化前提高了1.63 倍，活菌数达到9.04 log CFU/m L。