瓜蒌皮注射液及其中间体中17 种氨基酸含量测定及其变化规律研究

陶 香，张静娴，胡 青，孙 健，董 莹，丁金国，于 泓，沈盈盈，毛秀红，季 申*

（1.上海中医药大学，上海 201203； 2.上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203； 3.上海第一生化药业有限公司，上海 200240）

瓜蒌皮注射液是以瓜蒌皮为原料，利用现代工艺制成的中药注射液，具有行气除满、开胸除痹功效，常用于冠心病、稳定型心绞痛、心力衰竭的治疗［1-6］，具有改善心肌缺血、抗血栓、抗氧化、抗动脉粥样硬化等药理作用［7-9］。近年来，瓜蒌皮注射液临床应用范围日益扩大，在治疗心、脑、肺等脏器疾病中发挥着重要作用，以因动脉阻塞引起的心肌缺血缺氧性疾病居多［10-12］。

瓜蒌皮含有丰富的氨基酸，文献［13］ 测定了不同产地、品系该药材中18 种游离氨基酸的含量，发现高达37.71 mg/g； 文献［14］ 在双边栝楼果实各部位中检测了19 种氨基酸，其中果皮中含量较高的有瓜氨酸、精氨酸、赖氨酸等； 文献［15-18］ 报道了瓜蒌皮经水提醇沉、732 型阳离子交换树脂后制成注射液，主要富集氨基酸、核苷、生物碱等两性、碱性化合物，其中氨基酸含量最高。目前，瓜蒌皮注射液国家标准［19］采用紫外分光光度计测定总氨基酸含量，缺乏专属性，结果不够准确。因此，本实验测定瓜蒌皮注射液及其中间体中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸的含量，并考察其变化规律，以期为该制剂质量控制关键因素研究提供参考。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）； 电子分析天平［0.01 mg，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； 精密PH 计（瑞士Mettler-Toledo公司）。邻苯二甲醛（OPA） 购自美国Pickering Laboratories 公司； 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC） 购自美国Sigma-Aldrich 公司； 巯基丙酸购自美国Alfa Aesar 公司。氨基酸混合物（批号140624-201506，包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸） 及鸟氨酸（批号140847-201901）、瓜氨酸（批号110875-201607）、γ-氨基丁酸（批号100482-201601） 对照品均购自中国食品药品检验研究院，纯度均≥98%。瓜蒌皮注射液共6 批，批号2205203 （编号SX1）、2206201 （编号 SX2）、2206202 （编号SX3）、2205201 （编号 SX4）、2205202 （编号SX5）、2206203 （编号SX6），经水提醇沉、732 型阳离子交换柱等10 道工序后得到中间体，分别为煎煮合并液（编号Ⅰ）、减压浓缩液（编号Ⅱ）、一次酒沉液（编号Ⅲ）、一次酒沉浓缩液（编号Ⅳ）、二次酒沉液 （编号Ⅴ）、二次酒沉浓缩液（编号Ⅵ）、氨水洗脱液（编号Ⅶ）、洗脱浓缩液（编号Ⅷ）、调酸冷藏过滤液（编号Ⅸ）、瓜蒌皮注射液制剂（编号Ⅹ），均由上海第一生化药业有限公司生产。乙腈、甲醇为色谱纯，购自德国Merck公司； 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸均为分析纯，购自中国医药（集团） 上海化学试剂公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）； 流动相磷酸盐缓冲液（pH＝7.8，制备方法为取磷酸氢二钠71.8 g，超纯水溶解并稀释至1 000 mL； 取磷酸二氢钠2.76 g，去离子水溶解并稀释至100 mL，分别取两者915、85 mL 混合，摇匀，即得） （A） - ［甲醇-乙腈-水（45 ∶45 ∶10） ］ （B），梯度洗脱（0 ～6 min，1% ～10% B； 6 ～20 min，10% ～38% B； 20 ～28 min，38% ～40%B）； 体积流量1 mL/min； 柱温45 ℃； 检测波长0～20 min 338 nm，20 min 后（即赖氨酸出峰后） 262 nm； 进样量1 μL。

衍生化试剂包括0.4 mol/L 硼酸缓冲液（pH ＝10.2），制备方法为取硼酸适量，制成0.4 mol/L溶液，40%氢氧化钠溶液调节pH 至10.2，即得；1%OPA 溶液，制备方法为称取OPA 80 mg，加硼酸缓冲液7 mL、乙腈1 mL、巯基丙酸125 μL，混匀，即得； 0.5% FMOC 溶液，制备方法为称取FMOC 50 mg，适量乙腈-四氢呋喃（4 ∶6） 溶解，稀释至10 mL，即得。柱前衍生化反应中进样瓶1～4 分别为OPA、FMOC、水、硼酸盐缓冲液，分别从瓶3 中吸取0 μL （水，清洗针头）； 瓶4 中抽取7 μL （硼酸盐缓冲液）； 吸取样品1 μL； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗针头）； “在空气中” 以500 μL/min体积流量混合8 μL，共5 次； 瓶1 中吸取1 μL （OPA）； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗针头）； “在空气中” 以500 μL/min 体积流量混合9 μL，共25 次； 瓶2 中吸取1 μL （FMOC）； 瓶3中吸取0 μL （水，清洗针头）； “在空气中” 以500 μL/min 体积流量混合10 μL，共50 次； 进样。

2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、鸟氨酸各12.5 mg，天冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸各5 mg，γ-氨基丁酸25 mg，置于同一50 mL 量瓶中，0.1 mol/L 盐酸溶解并稀释至刻度，制成贮备液，分别精密量取适量，0.1 mol/L 盐酸稀释，即得（谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、鸟氨酸质量浓度均为10～250 μg/mL，天冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸质量浓度均为4 ～100 μg/mL，γ-氨基丁酸质量浓度为20～500 μg/mL）。

2.3 供试品溶液制备 分别精密移取瓜蒌皮注射液及其中间体（Ⅰ～Ⅹ） 3、1、3、1、3、1、1、1、1、1 mL 及同体积浓盐酸，置于10 mL 安瓿瓶中，在150 ℃下水解1 h，放冷，转移至蒸发皿中，10 mL 水分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣用0.1 mol/L 盐酸溶解并分别转移至10、25、10、25、10、25、10、25、25、10 mL 量瓶中，0.1 mol/L 盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，结果见表1，可知各氨基酸在各自范围内线性关系良好。

表1 各氨基酸线性关系Tab.1 Linear relationships of various amino acids

2.4.2 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸峰面积RSD 分别为2.79%、0.74%、1.09%、1.29%、0.46%、2.03%、3.59%、1.98%、1.25%、1.95%、0.73%、2.79%、4.01%、3.08%、0.69%、1.24%、2.89%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液（SX1），在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸含量RSD 分别为2.37%、2.48%、3.39%、3.31%、3.87%、5.29%、2.08%、1.77%、1.76%、2.38%、3.30%、2.05%、0.98%、2.80%、2.65%、3.08%、3.56%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取“2.4.3” 项下同一供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸峰面积RSD 分别为5.46%、3.28%、2.93%、5.18%、3.86%、3.40%、3.81%、4.19%、2.60%、2.31%、1.89%、4.71%、1.75%、3.51%、1.70%、3.87%、1.89%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密吸取本品（SX1）0.5 mL，平行6 份，按100%水平加入对照品溶液，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸平均加样回收率分别为118.32%、119.48%、110.13%、117.68%、100.60%、103.85%、107.18%、111.76%、84.60%、83.42%、112.51%、111.88%、85.76%、105.20%、113.28%、97.27%、103.07%，RSD 分别为1.68%、1.29%、2.14%、2.77%、1.48%、1.75%、7.94%、1.05%、3.93%、1.38%、3.91%、6.90%、2.53%、2.17%、0.91%、1.67%、7.83%。

2.5 样品含量测定 图1 显示，瓜氨酸含量从中间体Ⅵ至Ⅶ明显升高。再测定10 道工序相应中间体中17 种氨基酸含量，结果见表2，可知中间体Ⅰ中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸含量较高，酪氨酸、瓜氨酸含量较低； 制剂中γ-氨基丁酸、丙氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、瓜氨酸含量较高，酪氨酸、缬氨酸含量较低。

图1 瓜蒌皮注射液制备工艺流程及代表性色谱图Fig.1 Preparation process flow and typical chromatograms of Gualoupi Injection

表2 各氨基酸含量测定结果（μg/mL）Tab.2 Results for content determination of various amino acids （μg/mL）

2.6 主成分分析和热图分析 以10 道工序相应中间体的样品编号为变量，氨基酸含量的归一化值为观察值，采用 UV Scaling 方式预处理后通过SIMCA-P 13.0 软件进行主成分分析，结果见图2。由此可知，前2 个主成分累积方差贡献率为70.2%； 相同工序不同批次样品较聚集，表明工艺稳定性较好； 不同工序样品聚为3 组，分别为Ⅰ～Ⅱ（Group 1）、Ⅲ～Ⅵ（Group 2）、Ⅶ～Ⅹ（Group 3），表明工序Ⅲ、Ⅶ对氨基酸组成的影响最大，而工序Ⅶ后氨基酸组成非常相似，Group 3 中不同工序中间体难以区分； Ⅰ～Ⅱ中精氨酸、赖氨酸含量较高，而Ⅶ～Ⅹ中瓜氨酸、酪氨酸含量较高。

图2 主成分分析结果Fig.2 Results for principal component analysis

热图分析见图3。由此可知，氨基酸含量聚为3 类，与主成分分析结果基本一致； 以工序Ⅶ为分界点，精氨酸、酪氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸在制备过程中的含量由高转低，而脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸含量恰好相反； 鸟氨酸含量由高转低又升高，瓜氨酸在工序Ⅰ中的含量略高，Ⅱ～Ⅵ中非常低，Ⅶ中开始明显升高； 酪氨酸含量从工序Ⅶ开始逐渐升高，最终趋于稳定。

综上所述，工序Ⅶ对氨基酸组成的影响最大。732 型阳离子交换柱的填料为7%苯乙烯·二乙烯共聚体上带有磺酸基（-SO3） 的阳离子交换树脂，在溶液中解离出H＋，树脂解离后产生的SO3-能与溶液中带正电荷的物质结合，主要用于富集碱性物质或强酸性物质。瓜蒌皮煎煮液水提醇沉后主要富集了多肽、氨基酸、核苷等亲水性化合物，与离子交换剂的结合能力主要取决于其物理化学性质和等电点，pH＜pI，氨基酸和多肽带正电； pH＞pI，两者带负电［20］，并且环境pH 与等电点差值越大，与离子交换剂的结合能力越强； 被分离肽的电荷密度越大，与离子交换剂的结合能力也越强，以1 mol/L氨溶液（pH 约9.25） 洗脱阳离子交换柱时，pI＞pH 的氨基酸和多肽带正电，与树脂交换基团中的H＋发生交换而结合于柱上，如赖氨酸、精氨酸； pI＜pH 的两者带负电，无法与离子交换柱结合而被氨溶液洗脱下来，如脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸等，同时一些带正电荷、密度较大的肽与树脂交换基团中的H＋发生交换，结合于柱上，而带负电荷的肽被洗脱下来。另外，瓜氨酸通过阳离子交换柱后含量明显升高，结合文献［21］ 报道，推测可能是由于氨水洗脱过程中精氨酸在有氧条件下氧化生成瓜氨酸和一氧化氮，最后被富集到制剂中，从而使该成分含量大大增加。

3 讨论

3.1 氨基酸筛选 预实验选择20 种氨基酸进行色谱条件考察，发现组氨酸、甲硫氨酸、色氨酸含量较低，衍生试剂在相应色谱峰处有干扰，影响结果准确性，故未测定三者； 在谷氨酸、甘氨酸色谱峰之间存在一个较大的未知峰，对比空白试剂色谱图发现并非衍生试剂峰，并且经谷氨酰胺、天冬酰胺、羟脯氨酸、组氨酸、甲硫氨酸等对照品比对后也均不符合，后期将继续对其进行鉴定。

3.2 衍生条件优化 衍生化法检测氨基酸是在一定pH 和3-巯基丙酸（3-MPA） 存在下，OPA 首先与一级氨基酸反应，而二级氨基酸不与OPA 反应，与3-MPA 结合后可降低氨基酸疏水性，再用FMOC 对二级氨基酸脯氨酸进行衍生，故OPA 衍生化产物出峰时间比FMOC 衍生化产物更早，而过剩的FMOC 及其降解产物在二级氨基酸后出峰，不会干扰分析［22］。本实验考察了OPA、FMOC 在500 μL/min 速率下混合5、10、20、25、50、70、100 次时的衍生氨基酸峰面积，最终分别确定为25、50 次。

3.3 水解条件优化 本实验通过文献调研发现，一般在150 ℃下水解60 min 即可将结合氨基酸全部水解为游离型氨基酸，再对常用水解时间（30、60、90 min） 进行考察，为了确保注射液中结合型氨基酸全部水解，最终确定为60 min。

4 结论

本实验采用OPA-FMOC 在线衍生法测定瓜蒌皮注射液中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸的含量，具有良好的准确性、重复性和稳定性，对提高该制剂质量标准提供重要方法。然后，对10 道工序相应中间体中上述氨基酸含量进行测定，并开展主成分分析和热图分析，阐释生产过程中其变化规律，发现醇沉和阳离子交换树脂对其组成的影响最大，可为指导优化瓜蒌皮注射液生产工艺提供科学依据。