红芪搓条前后主要次级代谢产物变化规律研究

罗旭东，李昕蓉，李成义*，齐 鹏，梁婷婷，刘书斌，强正泽，何军刚，李 旭，魏小成，冯晓莉，2，王明伟

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2.敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000）

红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrysHand.-Mazz.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、生津养血等功效［1］，在调节机体免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等方面具有较好的药理作用［2-5］。

产地加工是中药材生产的重要环节，搓条作为红芪产地加工体系中的关键步骤，是该药材品质及商品形成的关键环节。前期报道，加工时间、程度对药材质量的影响较大［6-7］，产地加工不仅促使药材干燥进程，而且伴随着化学成分变化，如同类成分之间的相互转化及其含量的消长等［8］。

课题组前期发现，搓条、未搓条红芪在性状特征、一级纹理及皮孔、淀粉粒、木栓细胞、指纹图谱相似度等方面存在一定差异［9-10］，但缺少成分、质量差异方面的系统研究。因此，本实验探讨红芪搓条前后主要次级代谢产物变化规律，以期完善该药材质量控制方法，为其生产过程优化提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器和试剂 API 5500 三重四级杆LC-MS/MS 质谱系统（美国AB SCIEX 公司）； LC-30AD 超高效液相色谱系统（日本岛津公司）； BT25S 型电子分析天平（十万分之一）、BT124S 型电子分析天平（万分之一） ［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； DK-98-ⅡA 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）； YRE-301 旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）。腺苷 （批号N24D11W135689）、甜菜碱（批号DJ0615YA13）、毛蕊异黄酮苷（批号R31A10F96530）、毛蕊异黄酮 （批号 Y24N9Y75652）、芒柄花苷 （ 批号P03A10F84910）、芒柄花素（批号H06S9Z69494）、美迪紫檀素（批号Y12M11H112983）、染料木素（ 批号 H30A9Z69019）、γ-氨基丁酸 （ 批号Z08A8H33553）、木犀草素（批号O14HB197800）、甘草素 （批号Z20J8X40265）、异甘草素 （批号H03D9Z76567）、香草酸（批号H11J9Z65318）、阿魏酸（批号L03A9D57744） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均购自赛默飞世尔科技（中国） 有限公司。

1.2 药材 新鲜红芪于2021 年11 月采自陇南市武都区（北纬33°27′44.92″，东经105°4′18.44″，高度1 876.00 m），经甘肃中医药大学李成义教授鉴定为正品，洗净泥沙，去除杂质，分为搓条组（编号CT1 ～CT14） 和未搓条组 （编号WCT1 ～WCT14），未搓条组晾晒至干，而搓条组按照课题组前期优化工艺处理（红芪自然晾晒至含水量为52% ～59%时进行搓条，时间9 min，次数2 次），晾晒至干，粉碎，过4 号筛，见图1。

图1 红芪图片Fig.1 Images of Hedysari Radix

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 精密称取搓条、未搓条药材各3 g，加甲醇30 mL，80 ℃水浴提取1 h，过滤，滤液浓缩定容至10 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、异甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含上述成分31.25、15.63、6.25、3.13、15.63、0.78、2.50、6.25、6.25、15.63、12.50、62.50、6.25、2.50 μg 的贮备液，甲醇依次稀释成系列质量浓度，即得，避光保存于4 ℃冰箱中。

2.3 内标溶液制备 精密称取盐酸吡格列酮对照品2.00 mg，置于2 mL 量瓶中，甲醇溶解，制成质量浓度为1.00 mg/mL 的母液，量取适量，甲醇稀释至2 ng/mL，即得。

2.4 色谱条件 Waters CORTES C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）； 流动相0.2%甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脱（0～5 min，5% ～90%B； 5 ～7.5 min，90%B； 7.5 ～8 min，90% ～5% B； 8 ～13 min，5%B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温40 ℃；进样量2 μL。色谱图见图2。

图2 各成分色谱图Fig.2 Chromatograms of various constituents

2.5 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子扫描； 多反应监测 （MRM） 模式； 雾化气温度500 ℃； 碰撞气压力8 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 雾化气压力50 psi； 辅助气压力50 psi； 气帘气压力30 psi； 喷雾电压4 500 eV （负离子）、5 500 eV（正离子），其他质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，续滤液在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并以S/N≥3 为检测限，S/N≥10 为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.2 精密度试验 取“2.2” 项下对照品溶液适量，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定6 次，测得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、异甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜碱峰面积RSD 分别为1.65%、1.67%、1.86%、2.14%、2.07%、2.13%、1.56%、2.05%、1.13%、2.19%、0.98%、1.98%、1.80%、1.93%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取6 份药材（CT-1） 适量，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4”“2.5” 项条件下进样测定，测得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、异甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜碱含量RSD 分别为 2.69%、2.90%、2.80%、2.78%、2.66%、1.32%、2.55%、2.39%、1.66%、2.63%、2.90%、2.85%、2.96%、2.59%，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 取药材（CT-1） 适量，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定，测得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、异甘草素、香草酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜碱含量RSD 分别为2.91%、2.45%、2.75%、2.35%、2.69%、2.97%、2.93%、2.89%、2.90%、2.80%、2.69%、2.85%、2.96%、2.10%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密称取药材（CT-1）1.5 g，分别按50%、100%、150%水平精密加入对照品溶液，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、异甘草素、香草酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜碱平均加样回收率分别为98.14%、98.28%、97.78%、97.42%、98.60%、98.70%、99.25%、98.33%、98.38%、98.75%、98.05%、99.98%、98.66%、98.17%，RSD 分别为2.71%、2.04%、1.73%、1.99%、2.10%、2.36%、2.81%、2.08%、2.68%、2.64%、2.13%、1.54%、2.29%、2.01%。

2.6.6 样品含量测定 精密称定搓条、未搓条药材粉末各14 批，每批3.0 g，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。由此可知，2 种药材粉末中γ-氨基丁酸含量均最高，木犀草素含量均最低。

2.7 化学模式识别

2.7.1 独立样本t检验 表4 显示，搓条前后芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、香草酸、γ-氨基丁酸含量均有极显著差异 （P＜0.01），美迪紫檀素、染料木素、甘草素、腺苷含量均有显著差异（P＜0.05），而木犀草素、异甘草素、阿魏酸、甜菜碱含量均无显著差异 （P＞0.05）。

表4 独立样本t 检验结果Tab.4 Results for independent samples t tests

2.7.2 聚类分析 以各成分含量为变量，导入Ometaboanalyst 网页，差异 Ward 连接法结合Euclidean 距离进行分析，结果见图3。由此可知，各批药材聚为2 类，WCT1～WCT14 为一类，CT1～CT14 为一类，表明搓条、未搓条药材可得到较好的区分，并且其所含成分的含量存在差异。

图3 药材聚类热图Fig.3 Cluster heatmap for medicinal materials

2.7.3 主成分分析（PCA） 以各成分含量为变量，导入Ometaboanalyst 网页进行分析，结果见图4。由此可知，搓条、未搓条药材各自聚为一类，与“2.7.2” 项下结果一致，表明搓条对药材所含成分的总体特征构成了明显影响。

图4 药材PCA 得分图Fig.4 PCA score plot for medicinal materials

2.7.4 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA） 在PCA 分析基础上进行有监督模式的OPLS-DA 分析，结果见图5。由此可知，累积解释能力参数（R2X） 为0.658，累积解释能力参数（R2Y） 为0.928，模型预测能力参数（Q2） 为0.879，均大于0.5，表明模型稳定可靠，预测能力强，可用于区分搓条、未搓条药材，与“2.7.2” “2.7.3” 项下结果一致。

图5 药材OPLS-DA 得分图Fig.5 OPLS-DA score plot for medicinal materials

变量重要性 （VIP） 投影图见图6，以VIP值＞1.0 为标准筛选差异性成分，共得到6 种，分别为毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、γ-氨基丁酸、香草酸、毛蕊异黄酮、芒柄花苷，其中搓条药材中芒柄花素、γ-氨基丁酸、毛蕊异黄酮平均含量高于未搓条药材中（P＜0.01），毛蕊异黄酮苷、香草酸、芒柄花苷平均含量低于未搓条药材（P＜0.01），见图7。

图6 药材VIP 投影图Fig.6 VIP projection plot for medicinal materials

图7 各差异性成分含量箱形图Fig.7 Box diagrams for contents of various differential components

3 讨论与结论

本实验选择不同色谱柱［Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Waters CORTES C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） ］、流动相（水-乙腈/甲醇、0.1% /0.2% 乙酸铵-乙腈/甲醇、0.1% /0.2%甲酸-乙腈/甲醇），从敏感性、分离度、峰保留时间、峰形、消除基质效应等方面进行考察，最终确定为Waters CORTES C18色谱柱（50 mm× 4.6 mm，2.7 μm）、0.2% 甲酸-甲醇。

研究表明，搓条可增加红芪内部水分向外扩散速率，加快药材干燥，改善药材性状，皮紧实而细腻，全身较直，质地坚硬，致密，不易折断； 芒柄花素、毛蕊异黄酮、甘草素、γ-氨基丁酸含量升高，芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、香草酸含量降低，推测可能是在机械力作用下异黄酮苷类成分转化成异黄酮苷元类成分，其机制包括①搓条过程中在机械力作用下红芪温度升高，促进相关异黄酮合成酶活性发生变化［8，11］，诱导新代谢物产生、次生代谢物含量升高或降低等抗脱水机制［12-13］； ②芒柄花素等异黄酮类成分生物合成途径有关蛋白发生变化，力学信号到达机械力离子通道Piezo1，后者传导多种生化信号，引起次生代谢产物改变［14-15］；③机械力经过传导，引起芒柄花素合成途径上关键异黄酮合酶基因等表达或沉默，使得次生代谢产物含量发生变化［9，16-17］； ④搓条施加于药材后产生“机械力化学效应”［18-21］，促使细胞结构的改变及膜系统的破坏［22-23］，断开了细胞壁聚合物的分子间、分子内连接［24］，使次生代谢产物含量发生变化。今后，课题组将对此作深入研究。

综上所述，本实验考察红芪搓条前后主要次级代谢产物变化规律，初步阐释该工艺在药材品质形成过程中的重要作用，再基于多指标成分含量测定结合化学计量学分析来评价其合理性和科学性，可为其他根及根茎类药材的搓条提供理论依据和技术参考。