生地低聚糖雾化吸入后小鼠体内药动学研究

林佳丽，徐光临，时潇丽，刘 力

（上海中医药大学附属曙光医院药学部，上海 201203）

慢性阻塞性肺疾病是世界重大公共卫生问题，全球每年死亡病例超过300 万例，预计到2030 年将成为第三大死因［1-4］。生地低聚糖是生地黄经特定提取分离及纯化工艺得到的部位，以水苏糖为主要成分（含量高达40%）［5-6］，它来源于上海中医药大学附属曙光医院的院内制剂生地注射液，临床上用于治疗慢性阻塞性肺疾病，疗效显著［7］，对模型大鼠的气流限制有明显缓解作用，可用于延缓补全进行性发展，同时也证实了水苏糖是其主要药效物质［8-10］。

肺组织给药其有起效快、防止肝脏首过效应、减少全身不良反应的优势，在治疗呼吸系统疾病中显示出较大的应用潜力［11-13］。雾化吸入是治疗呼吸系统疾病的重要手段［14］，故本实验采用该方法给予小鼠生地低聚糖，并研究该成分体内药动学，旨在为经肺组织给药治疗慢性阻塞性肺疾病的新药开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； Triple-Quad 4500 质谱仪 （美国AB SCIEX 公司）； NE-C25S 型压缩雾化器（日本欧姆龙株式会社）。

1.2 试剂与药物 生地低聚糖（上海中医药大学附属曙光医院制剂实验室自制，为白色粉末，无臭，味甜，水苏糖含量为43.79%）。水苏糖（批号12031-202002，纯度89.9%）、耐斯糖 （批号111891-201704，纯度92.2%） 对照品（中国食品药品检定研究院）； 乙腈、甲醇为色谱纯； 水为超纯水。

1.3 动物 SPF 级BALB/c 小鼠，雄性，体质量22～25 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，动物生产许可证号SCXK （沪） 2018-0006。本实验经上海中医药大学动物伦理委员会批准（伦理号PZSHUTCM220919008）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Asahipak NH2P-50G 4A 保护柱（10 mm×4.6 mm）； 流动相水（A） -乙腈（B），梯度洗脱 （0 ～15.10 min，75% ～55%B）； 体积流量900 μL/min； 柱温25 ℃； 进样量10 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 负离子扫描； 多反应监测 （MRM） 模式； 离子源温度550 ℃，水苏糖其他质谱参数见表1。

表1 水苏糖质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for stachyose

2.3 溶液制备

2.3.1 内标溶液 精密量取耐斯糖对照品适量，置于10 mL 量瓶中，超纯水溶解并定容至刻度，得质量浓度为200 μg/mL 的贮备液，稀释至20 μg/mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.2 对照品溶液 精密称取水苏糖对照品适量，置于2 mL 量瓶中，超纯水溶解并定容至刻度，即得（该成分质量浓度为1 mg/mL），置于4 ℃冰箱中保存。

2.4 分组、给药与样品采集 66 只小鼠随机分为11 组，每组6 只，置于雾化系统［由欧姆龙压缩雾化器（工作气体流量≥4 L/min，喷雾速率≥0.2 mL/min，雾粒中位粒径2.2 μm，≤5 μm 的雾粒占比大于60%） 和小鼠雾化箱（32 cm×21.5 cm×17 cm） 组成，雾化后的药液通过导气管进入雾化箱］中，给药前自由活动，给药时口鼻吸入50 mg/mL生地低聚糖溶液6 mL，持续20 min，给药结束后静置5 min 以保证雾滴充分吸入，于0、0.16、0.33、0.67、1、2、4、8、12、18、24 h 眼球采血后脱颈椎处死并取肺组织，全血置于肝素钠离心管中，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，弃去沉淀，吸取上层血浆，肺组织在-20 ℃下保存。

2.5 样品处理

2.5.1 血浆 精密吸取小鼠血浆100 μL，置于1.5 mL 离心管中，精密加入300 μL 乙腈、5 μL 内标溶液，涡旋振荡5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液，加入100 μL 超纯水，涡旋振荡5 min 后再离心15 min，取上清液待测。

2.5.2 肺组织 精密称取小鼠肺组织100 mg，加入3 倍量生理盐水制成匀浆，精密吸取100 μL，加入300 μL 乙腈、5 μL 内标溶液，涡旋振荡5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液，加入100 μL 超纯水，涡旋振荡5 min 后再离心15 min，取上清液待测。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 取空白血浆、加入对照品（300 ng/mL） 和内标的空白血浆、给药8 h 后血浆样品各100 μL，按 “2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定； 取空白肺组织匀浆、加入对照品（300 ng/mL） 和内标的空白肺组织匀浆、给药8 h 后肺组织匀浆各100 μL，按“2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，水苏糖与内标可实现完全分离，未受到血浆和肺组织中内源性杂质干扰，表明该方法专属性良好。

图1 水苏糖LC-MS/MS 色谱图Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of stachyose

2.6.2 线性关系考察 取空白血浆100 μL，加入对照品溶液5 μL，制成质量浓度分别为50、100、300、1 500、3 000、6 000、12 000、36 000 ng/mL的溶液，按 “2.5” 项下方法处理，在 “2.1”“2.2” 项条件下各进样10 μL 测定； 取空白肺组织匀浆100 μL，加入对照品溶液5 μL，制成质量浓度分别为50、100、300、1 500、3 000、6 000、12 000、36 000 ng/mL 的溶液，按“2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2” 项条件下各进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品、内标峰面积比值为纵坐标（Y） 进行回归，并以S/N＝10 为定量限，结果见表2，可知在各自范围内线性关系良好。

表2 水苏糖线性关系Tab.2 Linear relationships of stachyose

2.6.3 准确度、精密度试验 制备水苏糖质量浓度为分别150、18 000、27 000 ng/mL 的质控样品，平行6 份，按“2.5” 项下方法处理，同一天内在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，计算日内精密度和准确度； 同法连续测定3 d，每天1 次，计算日间精密度和准确度，结果见表3，可知均符合生物样品分析要求。

表3 水苏糖准确度、精密度试验结果（n＝6）Tab.3 Results for accuracy and precision tests of stachyose （n＝6）

2.6.4 提取回收率、基质效应试验 制备水苏糖质量浓度分别为150、18 000、27 000 ng/mL 的质控样品，平行6 份，按“2.5” 项下方法处理，同一天内在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定水苏糖、内标峰面积A1、B1； 取空白血浆和肺组织适量，加入等量对照品、内标溶液使其达到与质控样品相同的质量浓度，按“2.5” 项下方法处理，同一天内在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定两者峰面积A2、B2，计算提取回收率A1/A2、B1/B2。分别取空白样品适量、水100 μL，加入等量对照品、内标溶液使其达到与质控样品相同的质量浓度，按“2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，计算基质效应，结果见表4，可知均符合生物样品分析要求。

表4 水苏糖提取回收率、基质效应试验结果（±s，n＝6）Tab.4 Results for extraction recovery and matrix effect tests of stachyose （±s，n＝6）

表4 水苏糖提取回收率、基质效应试验结果（±s，n＝6）Tab.4 Results for extraction recovery and matrix effect tests of stachyose （±s，n＝6）

样品成分理论质量浓度/（ng·mL-1）提取回收率/%RSD/%基质效应/%RSD/%血浆水苏糖15046.81±1.733.7123.1±3.422.8 18 00051.46±5.159.8116.6±6.095.2 27 00047.60±1.954.1115.9±9.468.2内标1 00056.47±3.486.2103.61±6.556.3肺组织水苏糖15063.06±4.497.196.67±5.856.1 18 00058.81±3.235.5106.0±3.693.5 27 00057.34±4.157.2105.1±5.455.2内标1 00056.49±3.085.597.71±7.107.3

2.6.5 稳定性试验 制备水苏糖质量浓度分别为150、18 000、27 000 ng/mL 的质控样品，平行6份，按“2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2”项条件下进样测定，分别在室温下放置4 h、4 ℃自动进样器中放置24 h、-20 ℃下放置30 d、连续3 d 在-20 ℃下反复冻融3 次，按“2.5” 项下方法处理，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，结果见表5，可知均符合生物样品分析要求。

表5 水苏糖稳定性试验结果（n＝6）Tab.5 Results for stability tests of stachyose （n＝6）

2.7 体内药动学研究 血药浓度-时间曲线见图2，再采用DAS 3.1.1 软件中的非房室模型计算主要药动学参数，结果见表6。由此可知，给药后在血浆中有一段吸收入血的时间，而在肺组织中的药物浓度达峰值，随后缓慢消除。

图2 生地低聚糖在小鼠血浆和肺组织中的药物浓度-时间曲线Fig.2 Drug concentration-time curves for R.glutinosa oligosaccharides in mouse plasma and lung tissue

表6 生地低聚糖主要药动学参数Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for R.glutinosa oligosaccharides

3 讨论与结论

方法学结果表明，样品提取回收率较低，故本实验采用乙腈沉淀法除蛋白。虽然水苏糖和内标在乙腈中的溶解度较低，部分会随蛋白沉淀，导致在提取步骤有损失，但质控样品提取回收率不具有统计学意义，RSD 均在10%以内，不影响药物测定，故本实验未探讨如何提高两者提取回收率，但在后续实验中将对样品前处理技术进行改进。

雾化吸入可将药物直接送达肺组织，起效快速，用药量少［15-16］。课题组前期分别考察生地低聚糖质量浓度在3、6、12、24、50 mg/mL 时的雾化效果，发现雾化吸入后在小鼠血浆和肺组织中均能测得药物，而且其含量随着雾化质量浓度增加而升高。为了便于药动学实验中不同采血时间点的血药浓度检测，本实验选择最高质量浓度的生地低聚糖溶液作为雾化溶液。另外，药物沉积位置与雾化颗粒直径相关，在0.5 ～10 μm 时可直达肺组织［17］，本实验采用欧姆龙压缩雾化器，雾化后颗粒粒径在2.2 μm 左右，可满足肺组织给药需求。

药物经雾化吸入后，在肺组织、气道中起到药效作用［17-19］。药动学研究结果表明，生地低聚糖雾化吸入后能较快地吸收入血，而且全身循环后消除较快； 与血浆比较，肺组织中药物含量在雾化给药结束后即达峰值，半衰期在4 h 左右，表明此时生地低聚糖可迅速分布到该器官中，随后滞留一段时间； 全身性不良反应与药物高浓度暴露有关，故前者可随后者Cmax降低而减少［20］。本实验发现，雾化吸入后肺组织中药物Cmax低于血浆中，表明生地低聚糖进入体循环浓度降低。

综上所述，小鼠雾化吸入生地低聚糖后药物迅速分布到肺组织，而且滞留时间较长，从而实现对该器官疾病快速、靶向治疗的目的，并可为经雾化吸入治疗慢性阻塞性肺疾病的相关新药开发提供依据。