碧雪散制备工艺优化

刘梓琛，吴 飞，郎 卿，林 晓，*

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203； 2.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海 201203； 3.上海市浦东新区北蔡社区卫生服务中心中医科，上海 201204）

相较于其他传统中药剂型，散剂制备工艺简便，但也需遵循一定原则，主要分为干燥、粉碎、过筛、混合、分剂量等环节。从关键质量属性角度来说，散剂重点要求含量均匀，色泽一致，故混合是关键操作，其传统方式有过筛混合、研磨混合（等量递增法和打底套色法等）、混合筒混合等。

碧雪散由石膏、人中白、冰片、青黛、硼砂、腰黄、朱砂组成，方中朱砂具有清心镇惊、安神解毒功效，雄黄具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟作用，两者常用于用于疮疡肿毒、咽喉肿痛、口舌生疮的治疗［1-3］，不仅在处方中属于颜色特殊的成分，也有着一定毒性［4-5］，故在制备工艺中混合步骤尤为关键，其均一性不仅会影响品质，更会影响安全性。因此，本实验在单因素试验基础上采用Box-Behnken 响应面法优化碧雪散制备工艺，以期为其他中药散剂研究提供参考。

1 材料

FA2104N 型电子分析天平（0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司）； XP205 型电子分析天平［0.01 mg，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； SQP 型电子分析天平［0.01 g，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； DFY-1000 型多功能高速中药粉碎机（摇摆式，温州顶历医疗器械有限公司）； EML200 Digital PlusT 型干式振动筛（德国Haver＆Boecker 公司）； SK7210HP 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）； TGL-18C 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）； RRM Mini-Ⅱ型三维混合器（德国JEngelsmann 公司）； ADCI-60-C 型实用型色差仪（北京市辰泰克仪器有限公司）； 沃特世Alliance e2695 型高效液相色谱仪，配置PDA 检测器和Empower 3 化学工作站［沃特世科技（上海） 有限公司］； 安捷伦7890A 型气相色谱仪，配置自动进样器ALS、FID 检测器和Chemstation 化学工作站（美国安捷伦公司）； Quanta 250 FEG 型扫描电镜（荷兰Philips 公司）； Malvern 2000 型激光粒度仪（英国马尔文公司）； 标准药典筛（杭州三思仪器有限公司）； BT-1000型粉体综合特性测试仪（丹东市百特仪器有限公司）。

冰片（批号200111）、炒硼砂（批号210608）、石膏（批号210701）、人中白 （批号190722）、青黛 （批号210421）（上海康桥药业有限公司）； 朱砂（批号20210410，上海养和堂中药饮片有限公司）； 雄黄（批号2012090346，上海雷允上中药饮片厂），均经专家鉴定为正品。碧雪散（自制，批号221001）。靛蓝（批号110716-200610）、靛玉红（批号110717-200204）、龙脑（批号110881-201709） 对照品（中国食品药品检定研究院）。N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）； 水为纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 散剂制备

2.1.1 粉碎 将人中白、青黛和硼砂分别粉碎成细粉，雄黄和朱砂水飞成极细粉，石膏和冰片混合粉碎成细粉。其中，人中白粉碎至细粉后在100 ℃下温浸8 h，80 ℃下干燥4 h，过筛，备用。

2.1.2 混合 目前，常用的混合方式有2 种，即直接混合法和等量递增法，前者是直接混合工艺一次性全部投料，流程简单，省时省力，但若处方中存在多种颜色组分，则会出现颜色不均匀的现象，而后者对存在多种颜色组分的混合均一性更好。本实验发现，直接混合法无法将散剂混合均匀，故选择等量递增法［6-7］。

2.2 取样方法 采用传统的五点法［8］，即在距离混合样品四角1 cm 处的4 个点，以及混合样品的中心点取样。

2.3 混合均一性评价 散剂重点要求含量均匀，色泽一致，故本实验以冰片中龙脑和青黛中靛蓝、靛玉红为含量均匀的评价指标； 采用色差计测定色差值，作为色泽一致的评价指标。采用五点取样法进行取样，测定色度值L、a、b 及靛蓝＋靛玉红、龙脑含量，以其RSD 为混合均一性的评价指标，其中前三者权重赋值分别为25、25、50，后两者权重赋值分别为50、50，计算综合评分Y，公式为Y＝色度值RSD×0.2＋（靛蓝＋靛玉红） 含量RSD×0.4＋龙脑含量RSD×0.4。

2.3.1 色差值测定 采用色差计［9］对颜色关键感官属性进行客观的数字化评价，其中L 代表亮度，是指色彩中的深浅、明暗程度，数值为0 ～100，0 表示黑色，100 表示白色； a 代表红绿值，数值为-120 ～120，正值为红，负值为绿，0 为中性色； b 代表黄蓝值，数值为-120 ～120，正值为黄，负值为蓝，0 为中性色。前期预实验发现，每次测定时色度值b 的差异最大，而成型后的颜色也主要为蓝色，故以其为主要指标进行评价。

2.3.2 HPLC 法测定靛蓝、靛玉红含量

2.3.2.1 对照品溶液制备 精密称取靛蓝、靛玉红对照品适量，置于量瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺适量，溶解，制成两者质量浓度分别为0.993、0.83 mg/mL 的贮备液，精密吸取适量，置于同一量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL 分别含两者496.5、24.9 μg）。

2.3.2.2 供试品溶液制备 取本品 （批号221001） 约0.3 g，精密称定，置于磨口锥形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺30 mL，称定质量，超声（功率180 W，频率53 kHz） 提取45 min，放冷，N，N-二甲基甲酰胺补足减失的质量，吸取1 mL 上清液，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.3.2.3 色谱条件 参考文献［10］ 报道，QS-C18Plus 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相甲醇-水（75 ∶25）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长289 nm； 进样量10 μL。

2.3.2.4 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品（N，N-二甲基甲酰胺） 溶液适量，在“2.3.2.3” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3.2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液（含靛蓝496.5 μg/mL、靛玉红24.9 μg/mL） 0.5、1、1.5、2 mL，置于量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，在“2.3.2.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，得方程分别为Y＝3 225.5X＋663 373 （r＝0.998 7）、Y＝2 899.9X＋2 232.3 （r＝0.999 9），分别在9.93 ～496、0.498 ～24.9 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.2.6 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.2.3”项色谱条件下进样测定6 次，测得靛蓝、靛玉红峰面积RSD 分别为0.3%、0.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.2.7 重复性试验 取本品（批号221001） 6 份，按“2.3.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2.3” 项色谱条件下进样测定，测得靛蓝、靛玉红含量RSD 分别为1.8%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、16、24 h 在“2.3.2.3” 项色谱条件下进样测定，测得靛蓝、靛玉红含量RSD 分别为0.5%、1.7%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 GC 法测定龙脑含量

2.3.3.1 对照品溶液制备 精密称取龙脑对照品适量，置于量瓶中，乙酸乙酯溶解，即得 （该成分质量浓度为10.17 mg/mL）。

2.3.3.2 供试品溶液制备 精密称取本品粉末0.3 g，置于10 mL 量瓶中，乙酸乙酯溶解，超声处理，过滤，乙酸乙酯定容至刻度，即得。

2.3.3.3 色谱条件 DM-WAX 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 进样体积1.0 μL； 分流比20 ∶1； 进样口温度180 ℃； 载气氮气，体积流量1.0 mL/min； 恒流模式； 柱温140 ℃； 检测器温度250 ℃； 尾吹气氮气-氢气-空气（25 ∶30 ∶400）。

2.3.3.4 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品（乙酸乙酯） 溶液适量，在“2.3.3.3” 项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图2 龙脑GC 色谱图

2.3.3.5 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.025、0.05、0.25、0.50、0.75、2.50 mL，置于5 mL 量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，定容，在“2.3.3.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝720.84X-10.01（r＝1.000 0），在0.10～10.17 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.3.6 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.3.3”项色谱条件下进样测定6 次，测得龙脑峰面积RSD 为0.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.3.7 重复性试验 取本品（批号221001） 6 份，按“2.3.3.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.3.3” 项色谱条件下进样测定，测得龙脑峰面积RSD 为1.1%，表明该方法重复性良好。

2.3.3.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、12、24 h 在“2.3.3.3” 项色谱条件下进样测定，测得龙脑峰面积RSD 为2.4%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 单因素试验

2.4.1 粉末加入顺序 按表1 顺序加入组方药材粉末，计算综合评分，结果见图3。由此可知，顺序A 综合评分最低，表明混合最均匀。

表1 粉末加入顺序

图3 粉末加入顺序对综合评分的影响

2.4.2 混合转速 混合转速会对物料混合状态及最终的混合均匀度产生影响［11］。采用等量递增法，将组方药材粉末分别在混合转速25、30、35、40 r/min 下混合，每次20 min，平行5 份，计算综合评分，结果见图4。由此可知，随着混合转速增加综合评分先降后升，为35 r/min 时最低。

图4 混合转速对综合评分的影响

2.4.3 混合时间 采用等量递增法，将组方药材粉末以35 r/min 混合转速按顺序A 混合3 次，每次混合时间分别为10、20、30、40 min，平行5 份，计算综合评分，结果见图5。由此可知，随着混合时间延长综合评分降低，在20 min后程度趋缓。

2.4.4 填充率 填充率会对混合均一性产生影响［11］。采用等量递增法，将组方药材粉末以35 r/min 混合转速混合20 min，填充率分别为5%、10%、15%、20%、25%，平行5 份，计算综合评分，结果见图6。由此可知，填充率增至20%后综合评分升高，其原因可能是混合设备功率较小，动力不足，导致填充率较低时混合桶中的物料未得到充分混合，从而出现不均匀的现象。

图6 填充率对综合评分的影响

2.4.5 响应面法 在单因素试验基础上，以混合时间（A）、混合转速（B）、填充率（C） 为影响因素，色度值RSD 及靛蓝＋靛玉红、龙脑含量RSD 的综合评分（Y） 为评价指标，进行三因素三水平设计［12］，结果见表2。

表2 响应面法设计与结果

对表2 数据进行拟合，得二次二项式方程为Y＝5.35-0.557 5A＋0.381 2B＋0.38C- 0.072 5AB- 0.957 5AC＋0.425 0BC-0.373 0A2-0.090 5B2-1.23C2（R2＝0.851 1），方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.05，具有高度显著性； AdjR2为0.659 7，表明模型拟合程度良好； 失拟项P＞0.05，表明模型误差较小； 因素A、AC、C2有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。响应面分析见图7。

表3 方差分析结果

图7 各因素响应面图

2.4.6 验证试验 采用Design-Expert 软件，确定最优工艺为混合时间20 min，混合转速35 r/min，填充率10%。考虑到工艺放大和生产成本，在上述优化工艺基础上进行4 批验证试验，结果见表4，可知随着填充率增加综合评分升高，与单因素试验结果一致。在实际生产过程中，增加填充率能大幅度节约生产成本，从而提高生产价值； 当填充率从10%增加到20%时，靛蓝＋靛玉红、龙脑含量RSD 均在4%左右，可满足产品合格要求［13］。综上所述，虽然最优水平组为1 号，但考虑到实际生产可行性，也可适当增加填充率。

表4 验证试验结果（n＝4）

2.5 散剂表征

2.5.1 物性参数 测定表4 各批样品的休止角、卡尔指数、豪斯纳比值、粒径［14］，结果见表5。由此可知，各物性参数之间均无显著差异（P＞0.05），表明该工艺稳定可行。

表5 物性参数测定结果（±s）

表5 物性参数测定结果（±s）

试验号休止角/（°）卡尔指数豪斯纳比值粒径（d0.5）/μm粒径（d0.9）/μm 1 41.30±0.010.451.8325.44±0.17128.37±3.73 2 41.00±0.030.461.8527.08±0.28128.75±1.56 3 42.00±00.481.9127.21±0.32129.12±3.21 4 41.00±00.471.8827.41±0.49130.30±4.67

2.5.2 微观形貌 采用导电双面胶将3 种工艺（物理混合法、直接混合法、等量递增法混合） 所得样品固定于电镜载物台上，通过溅射仪进行表面喷金，在20 kV 加速电压下以扫描电子显微镜（SEM） 观察表面结构及物料混合状态，结果见图8。由此可知，物理混合法、直接混合法所制备的样品粉末分布不均匀，表面结构不规整； 等量递增法所制备的样品粉末分布均匀，表面较光滑规整。

图8 碧雪散SEM 图

3 讨论与结论

混合是制剂制备过程中非常重要的环节，其结果直接关系到制剂的外观形态及内在质量，对多组分物质含量均一性意义重大［15］。含量均匀度［16-17］是反映制剂安全、稳定、可控、有效的重要指标，直接影响其临床效果，而色差值［18］是直接反映样品混合均一性的指标。随着检测技术不断发展与进步，除化学成分含量外物理学参数也可作为混合均一性评价指标，如文献［19］ 采用色差计测定青黛、白矾细粉及细粉混合物和复合粒子色度值，作为混合均一性评价指标； 文献［20］ 选择色度值作为小金丸质量均一性的评价指标。

本实验发现，碧雪散最优混合工艺为混合时间20 min，混合转速35 r/min，填充率10%，其混合均一性较好，再测定主要成分含量，可知药效更稳定，安全性更高［21］，接着从物性参数、微观表征方面分析验证组之间的物性差异，结果无显著差异。

散剂作为传统剂型之一，临床使用历史悠久，疗效也经过时间检验，但近来鲜有其制备工艺的报道。本实验首次从色差值、化学含量、物性参数、微观表征多角度来对碧雪散制备工艺进行优化，使其更具合理性同时增加了科学内涵，同时可为关于其他中药散剂的相关研究添砖加瓦。