灵芝固态发酵三七渣产漆酶工艺优化

吉栗漫，谭显东，乔翅嵩，魏 琨，陈 楠

（成都信息工程大学，四川 成都 610225）

漆酶是一种多功能的含铜氧化还原酶［1-2］，在自然界中分布于多种植物［3］、真菌［4-5］、细菌［6-7］和少数昆虫中，它能催化多种芳香族化合物发生氧化反应，在反应中分子氧作为电子受体被还原成水。目前，漆酶可分为真菌漆酶、细菌漆酶和植物漆酶。其中，真菌漆酶具有更好的热稳定性、金属离子耐受性和更高的底物催化氧化性，在食品、制浆造纸、纺织工业以及环境保护领域有着广泛的应用［8-11］。

三七渣是三七经乙醇提取有效成分三七皂苷后产生的残渣，其中含有大量的粗纤维、粗多糖、淀粉、粗蛋白、粗脂肪等有机物和磷、钙、镁等矿质元素以及一些微量元素［12］，可作为原料发酵用于生产蛋白饲料、生防制剂、红色素、灵芝菌质等产品［13-16］。为了降低漆酶的生产成本，本研究以三七渣为基质，以金地灵芝为菌种固态发酵产漆酶，并通过响应面分析法优化发酵工艺条件，提高产酶效率，以期为其深入研究提供参考。

1 材料

1.1 药材 三七渣购自成都市某中成药厂，经过晾晒、粉碎、过筛等工艺后置于干燥器中保存，其主要成分为总糖48.87%、淀粉30.35%、粗纤维27.45%、粗蛋白12.28%、真蛋白9.97%、还原糖2.19%［17］。金地灵芝（审定编号川审菌2003008） 由四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物室提供。

1.2 试剂 酵母浸出粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铜、硫酸镁、吐温80、藜芦醇、磷酸二氢钠均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂； ABTS 为分析纯，购自阿拉丁试剂（上海） 有限公司。

1.3 仪器 PYX-250H-C 恒温恒湿培养箱购自韶关市科力实验仪器有限公司； THZ-92A 气浴恒温振荡器购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司； BSA224S 电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司； WFJ7200 分光光度计购自尤尼柯（上海） 仪器有限公司； LDZX-50KB 高压灭菌锅购自上海申安医疗器械厂。

2 方法

2.1 培养基培养

2.1.1 马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基 取马铃薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氢钾0.10 g、硫酸镁0.06 g、琼脂粉2.0 g，置于100 mL 蒸馏水中混匀，121 ℃灭菌30 min，即得。

2.1.2 种子液培养基 取马铃薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氢钾0.10 g、硫酸镁0.06 g，置于100 mL 蒸馏水中混匀，即得。

2.1.3 三七渣固体培养基 取三七渣10.0 g，过60 目筛，加入酵母浸出粉8%、硫酸铜0.07%、磷酸二氢钠0.4%、硫酸镁0.4%、吐温80 0.05%、藜芦醇0.025%、水60%，121 ℃灭菌30 min，即得。

2.2 种子液制备 将金地灵芝菌种接入PDA 培养基中，于28 ℃下恒温培养5～6 d，用打孔器在培养菌种的培养皿边缘打取0.25 cm2菌丝块，接入装有150 mL 种子液培养基的锥形瓶中，置于气浴恒温振荡器上，在180 r/min、28 ℃下培养6 d。

2.3 漆酶粗酶液制备 待培养结束后将发酵物剪碎，向锥形瓶中加入150 mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在40 ℃下水浴振荡1 h，结束后用纱布过滤，滤液置于高速离心机中，5 000 r/min 离心15 min，离心后取上清液，即得。

2.4 漆酶活性测定 参照文献［18-19］ 报道，采用ABTS法。将0.05 mL 漆酶粗酶液与1 mL 1 mmol/L ABTS、2.95 mL 缓冲液混合后加入试管中，35 ℃水浴3 min，在420 nm波长处测定吸光度，平行3 次，取平均值。

2.5 单因素试验

2.5.1 发酵温度 将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，接种量20%，发酵时间13 d，装样量10.0 g，发酵温度分别为24、26、28、30、32 ℃，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。由图1 可知，发酵温度为28 ℃时漆酶活性最高； 低于28 ℃时金地灵芝生长缓慢，产漆酶效果较差； 高于28 ℃时漆酶活性降低，这主要是因为固体发酵过程中的聚热现象容易引起菌体死亡。Pablo等［20］研究发现，在28 ℃时以稻谷和农业残余物固态发酵灵芝菌产漆酶酶活最高。

图1 发酵温度对漆酶活性的影响

2.5.2 接种量 将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，发酵温度28 ℃，发酵时间13 d，装样量10.0 g，接种量分别为10%、15%、20%、25%、30%、35%，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。接种量大小会直接影响菌种在培养基中的发酵速度和产酶效率［21］。由图2 可知，接种量为25% 时漆酶活性最高； 为10%时漆酶活性较低，这可能是因为接种量偏小致使菌丝量较少，漆酶的合成减少； 大于25%时漆酶活性随接种量的增大而降低，说明过高的接种量不利于分泌漆酶，可能是接种量过大使培养基中生物量大，致使营养物质消耗过快，灵芝代谢提前进入衰亡期，漆酶活性随之降低。

图2 接种量对漆酶活性的影响

2.5.3 发酵时间 将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，发酵温度28 ℃，接种量20%，装样量10.0 g，发酵时间分别为6、8、10、12、14、16、18、20 d，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。由图3可知，发酵时间为12 d 时漆酶活性最高； 随着发酵时间延长，发酵体系中的微生物逐渐由适应期、对数生长期、稳定期步入衰亡期，所以其代谢产物漆酶的酶活也随之呈现先逐渐升高，而后又降低的趋势，这是由于随着发酵时间的增加，灵芝代谢产物在培养基中不断积累，产生抑制作用，影响了漆酶的分泌［21］。

图3 发酵时间对漆酶活性的影响

2.6 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，以发酵温度（A）、接种量（B）、发酵时间（C） 为影响因素，漆酶活性（Y） 为评价指标，采用Design-Expert 8.0.6 软件建立三因素三水平试验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 Box-Behnken 响应面法因素水平

表2 Box-Behnken 响应面法设计与结果

将表2 数据导入Design-Expert 8.0.6 软件进行多元二次回归拟合，得方程为Y＝3.35-0.016A＋0.11B＋0.36C-0.11AB＋0.095AC＋0.081BC-0.47A2-0.28B2-0.11C2，方差分析见表3。由此可知，接种量和发酵时间对漆酶活性的影响极显著（P＜0.01），发酵温度不显著（P＞0.05）；F值越大，对响应值的影响越大［22-23］，各因素影响程度依次为发酵时间（C） ＞接种量（B） ＞发酵温度（A）； 模型P＜0.000 1，具有高度显著性； 失拟项P＝0.228 6，表明模型拟合度较高，误差较小，可用于预测分析； 因素AB、AC、BC、A2、B2、C2对漆酶活性影响呈极显著程度（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken 响应面法方差分析结果

响应面分析见图4。参考文献［24-26］ 报道，当发酵时间固定时，随着接种量的增加和发酵温度的升高，漆酶活性呈现先升高后降低的趋势，等高线图呈椭圆形且响应面呈凸形，表明发酵温度和接种量有较显著的交互作用；当接种量固定时随着发酵时间的延长，漆酶活性呈现逐渐升高的趋势，而随着发酵温度的升高，漆酶活性呈现先升高后降低的趋势； 当发酵温度固定时，接种量和发酵时间存在极显著的交互作用，而随着发酵时间和接种量的增加，漆酶活性呈现逐渐升高的趋势。

图4 各因素响应面图

3 结论

最佳条件为发酵时间14 d，发酵温度28.09 ℃，接种量26.65%，在此条件下进行发酵培养时漆酶活性为3.644 U/g。因此表明，利用响应面法优化灵芝固态发酵三七渣非常有效，可为后续三七渣固态发酵的工业化提供基础依据。