栀子金花汤对脓毒症大鼠肠黏膜屏障及相关炎症因子的影响

孙素灵，姜 逸，陆 雄，吴雪卿，杨孙虎，王 鸣*

（1.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院普外科，上海 200082； 2.上海中医药大学科技实验中心细胞生物与组织病理学实验室，上海 201203； 3.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

脓毒症是一种由感染引起宿主强烈炎症反应并伴发器官功能障碍的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［1］。尽管近年来脓毒症治疗有所进展，但它仍然是重症监护病房患者最常见的死亡原因之一［2-3］。一项全球性的脓毒症发生率和死亡率回顾性研究结果显示，仅在2017 年全球脓毒症患者人数累计4 890 万例，其中1 100 万例患者报告死亡，占全球死亡人数的19.7%［4］。肠道是参与和加重脓毒症的中心器官，被认为是全身炎症反应综合征的“引擎”［5］。尤其在盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP） 模型中，肠屏障损伤导致肠道通透性增加，促使管腔微生物和内毒素进入循环，诱导多种炎症介质释放进一步加剧多器官功能衰竭［6］。

栀子金花汤出自《医宗金鉴·杂病心法要诀》［7］，在黄连解毒汤的基础上添加一味大黄，对热毒内蕴患者有奇效。已有研究证实栀子金花汤可以通过调节炎症介质改善脓毒症腹腔感染［8］，栀子金花汤保留灌肠在肛窦炎治疗过程中亦可发挥良好的抑菌作用［9］。关于栀子金花汤对脓毒症肠黏膜屏障的影响及机制探索不多，本研究旨在为相关临床研究提供实验室依据。

1 材料

1.1 实验动物 SD 雄性大鼠30 只，8 周龄，体质量（200±20） g，购自杭州医学院［实验动物生产许可证号SCXK （浙） 2019-0002］，饲养于上海中医药大学附属市中西医结合医院实验动物中心，温度（25±2）℃，相对湿度（60±10）%，光照日夜循环各12 h，自由饮食饮水，并按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.2 药物 生栀子、黄芩（批号20230421、2023030707，上海养和堂中药饮片有限公司）； 黄连（批号220809，上海青浦中药饮片有限公司）； 黄柏（批号230508，上海虹桥中药饮片有限公司）； 大黄（批号20221117，上海万仕诚药业有限公司），药材均购自上海市中西医结合医院中药房，经专家鉴定为正品。栀子金花汤由栀子15 g、黄连15 g、黄芩10 g、黄柏10 g、大黄3 g 组成，药材加蒸馏水1 L 浸泡30 min，武火烧开转文火煎煮30 min，过滤，滤渣加蒸馏水1 L 复煎30 min，过滤，合并2 次滤液，加热浓缩至生药量3.6 g/mL。根据人与大鼠体表面积计算法换算，栀子金花汤低、中、高剂量组为6、18、36 g/kg，每天相当于临床剂量的（1、3、6 倍）。

1.3 试剂 TNF-α、IL-10、IL-1β、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测试剂盒（批号230714204R、230714229R、230714225R、230714245R，江苏酶免实业有限公司）； 伊红和苏木素染液 （批号220602，上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司）； 25%戊二醛水溶液、乙醇（批号20200109、20210728，国药集团化学试剂有限公司）； 锇酸［批号10194309，阿法埃莎（中国） 化学有限公司］； 环氧树脂E-51 （昆山绿循电子材料有限公司）； 异弗烷（批号20230403，青岛欧博方医药科技有限公司）。

1.4 仪器 Axio imager 2 正置荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司）； Tecnai G2 spirit 透射电子显微镜（美国FEI 公司）；Tianshi 988 洗板机（北京天石天力医疗器械技术开发中心）； Rayto RT-6100 酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）； 电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司）； TG16W 微量高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）； TGL16M 台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）； HT-111B 恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司）； EasyWeLL 系列JY98-IIIN 细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将大鼠随机分为假手术组、模型组和栀子金花汤高、中、低剂量组，每组6 只。参考文献［10］ 报道，采用盲肠结扎穿孔（CLP） 技术建立脓毒症大鼠模型。大鼠吸入异氟烷麻醉，麻醉后固定于鼠板，继续予以异氟烷维持。大鼠腹部剃毛备皮，用75% 乙醇消毒，用手术剪刀从大鼠腹部正中开口（倒T 型） 暴露腹腔，将盲肠轻轻拉出并分离肠系膜，在距盲肠末端1 cm 处用3-0号无菌手术缝线结扎，然后用22G 针头在盲肠结扎远端中央区域贯通穿刺2 次（注意避开血管），轻微挤压盲肠，确保穿刺点通畅，随后将肠段送回腹腔，用6-0 号无菌手术缝线关闭腹膜及腹肌，最后缝合皮肤； 假手术组除不进行盲肠结扎与穿孔外，其余手术操作同模型组。手术结束后，大鼠于鼠笼内观察1 h 后放回动物饲养中心继续饲养。其中模型组死亡2 只。造模后次日，栀子金花汤高、中、低剂量组灌胃给予6、18、36 g/kg 药液，假手术组和模型组灌胃给予生理盐水，每天2 次，每次间隔12 h，连续给药3 d［11］。

2.2 脓毒症模型评判 给药结束后，参考文献［12］ 报道，从外观、自主意识、自主活动、对刺激的反应、眼睛是否有分泌物、呼吸频率、呼吸质量7 个指标进行评价，每个指标分成5 个等级（0～4 分），总分为7 个指标的分数相加，最高分为28 分，若大鼠出现死亡则记为最高分。评分标准见表1。

表1 脓毒症模型评分标准

2.3 HE 染色观察回肠组织病理变化 末次给药后禁食不禁水12 h，次日采用异氟烷麻醉大鼠后，取血5 mL，并取回肠部位。取部分回肠于10%中性甲醛中固定，乙醇梯度脱水后进行石蜡包埋，切片，依次使用二甲苯、乙醇脱蜡，苏木素染核，盐酸乙醇分化，伊红染胞浆，自然晾干后树脂封片，于光学显微镜下观察回肠组织病理结构变化。

2.4 透射电镜观察回肠组织超微结构 取部分回肠段固定于2.5%戊二醛中，0.1 mol/L PBS 充分浸洗3 次后，依次使用1%锇酸后固定，梯度乙醇、丙酮脱水，采用环氧树脂618 浸透固化，超薄切片70 nm，使用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，蒸馏水洗3 次，自然晾干后于透射电镜下观察超微结构。

2.5 ELISA 法检测血清及回肠组织DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平 血液样本室温放置2 h，3 500 r/min 离心10 min，取上层血清，备用； 取适量回肠组织，加入0.1 mol/L PBS 破碎匀浆，离心取上清，蛋白定量后备用。按照相应试剂盒说明书检测血清及回肠组织DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平。

2.6 统计学分析 通过GraphPad Prism 9.0.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 栀子金花汤对脓毒症大鼠脓毒症评分的影响 如图1所示，与假手术组比较，模型组脓毒症评分升高 （P＜0.01），平均26 分，提示造模成功； 与模型组比较，栀子金花汤中、高剂量组脓毒症评分降低（P＜0.01）。

图1 各组大鼠脓毒症评分（±s，n＝4～6）

3.2 栀子金花汤对脓毒症大鼠回肠组织病理形态的影响如图2 所示，假手术组大鼠回肠各层结构完整，肠绒毛排列整齐，未见炎症细胞浸润； 模型组大鼠回肠结构破坏严重，肠绒毛排列紊乱，部分肠上皮层脱落，黏膜层可见大量炎性细胞聚集，以中性粒细胞为主； 与模型组比较，栀子金花汤各剂量组回肠结构基本完整，少量肠上皮细胞脱落，低剂量组黏膜层炎性细胞浸润面积减少，中、高剂量组炎性细胞数量偶见且优于低剂量组。

图2 各组大鼠回肠组织HE 染色（×200）

3.3 栀子金花汤对脓毒症大鼠回肠组织黏膜屏障超微结构的影响 如图3 所示，假手术组大鼠肠黏膜上皮细胞结构完整、边界清晰，细胞器、连接结构正常； 与正常组比较，模型组大鼠肠上皮细胞结构破坏严重，表现为微绒毛大量脱落，连接结构疏松不明，细胞膜破碎； 与模型组比较，栀子金花汤低剂量组无明显变化，中、高剂量组大鼠肠上皮细胞结构相对完整。

图3 各组大鼠回肠组织超微结构（×8 200）

3.4 栀子金花汤对脓毒症大鼠血清和回肠组织DAO 及炎症因子水平的影响 如图4 ～5 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清和回肠组织DAO 水平升高（P＜0.01），提示肠黏膜细胞受损，回肠机械性屏障完整性破坏； 促炎因子TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.01），而血清抗炎因子IL-10水平降低（P＜0.05），回肠组织IL-10 水平无明显变化（P＞0.05）。与模型组比较，栀子金花汤中、高剂量组血清IL-1β 水平及血清和回肠组织DAO、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清和回肠组织IL-10 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 低剂量组血清DAO、IL-1β 水平降低（P＜0.01），血清IL-10 水平升高（P＜0.01）； 中剂量组回肠组织IL-1β 水平降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠血清DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

图5 各组大鼠回肠组织DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

4 讨论

脓毒症病情凶险，是重症监护病房患者常见死亡原因［3］。随着现代医学发展脓毒症主流的抗感染治疗和器官功能支持技术获得了长足进步，但脓毒症的ICU 监测和治疗花费颇多，严重消耗公共医疗资源。疾病预后差，又拖累患者的后期生活质量。从个人家庭和社会层面，脓毒症都造成了巨大威胁。如何拓展脓毒症的治疗手段，降低脓毒症的重症死亡率，是各类临床或实验室研究所面临的严苛挑战。脓毒症机制复杂尚未阐明，在CLP 模型中盲肠创伤诱导免疫系统过度激活，炎症介质的触发、增强和放大效应是病理核心［13］。

中医经典中并无“脓毒症” 对应病名，诸医家普遍将其归入“伤寒” “温病” “疫病” 范畴，可参见“异病同治” 或“同病异治” 理论予以治疗。《医宗金鉴》 记载栀子金花汤主治痘中厥逆，因阳毒内攻，热极反寒，致热厥者，与脓毒症早期“毒热证机理相合”。栀子金花汤方组黄芩、黄连、黄柏、栀子、大黄，在黄连解毒汤基础上添加一味大黄形成。黄连解毒汤主治三焦火毒，且多项研究证实黄连解毒汤对脓毒症早期之毒热证有较好抗炎疗效，在中医临床应用于各类感染性疾病和胃肠道疾病等［14-15］。此外大黄性味苦、寒，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒的功效。现代药理研究证实大黄主要有效成分大黄素可以通过TLR4 信号通路减轻LPS 诱导的肠上皮细胞损伤，并上调缝隙接连蛋白CX43 表达［16］。本实验结果表明，栀子金花汤中、高剂量组可明显改善CLP 模型大鼠回肠黏膜层炎症细胞浸润，减少中性粒细胞积聚，降低血清和局部回肠组织相关促炎因子TNF-α、IL-1β 水平，升高抗炎因子IL-10 水平，提示栀子金花汤对脓毒症大鼠具有较好的抗炎作用。

肠道作为脓毒症多器官功能障碍综合征关键一环，也是非肠源性脓毒症的靶目标，近乎半数的脓毒症患者伴严重肠道功能障碍［17］。而肠上皮细胞作为肠道重要的生理屏障，一旦肠上皮完整性丧失，细菌和内毒素移位入血，由此诱导一系列级联反应造成多器官衰竭。DAO 是一种分布在人类和哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中的高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度［18］。本实验结果表明，栀子金花汤中、高剂量组肠绒毛排列相对整齐，结构相对完整； 肠上皮超微结构损伤有所改善，肠上皮细胞结构相对完整，微绒毛脱落减少，连接结构相对紧密； 血清和回肠组织DAO水平减少。

综上所述，栀子金花汤可以改善CLP 致脓毒症大鼠模型血清和回肠组织炎症反应，通过保护肠上皮细胞及其连接结构维护肠屏障的完整性。本研究为后续栀子金花汤减轻炎症、保护肠屏障来改善脓毒症的深入机制研究提供前期基础。