血满草酸性多糖的化学修饰及其免疫活性研究

刘 瑜，刘浩博，钟政昌，袁 雷

（西藏农牧学院，食品科学学院，西藏特色农牧资源省部共建协同创新中心，生物技术中心，西藏 林芝 860000）

多糖是中草药的主要活性成分之一，因其在调节机体免疫［1］、抗肿瘤［2］、抗病毒［3］、降血糖［4-5］等方面表现出较好的生物功能而备受关注。而多糖的结构修饰对多糖生物活性也会产生重要的影响，通过结构修饰可提高多糖原有的生物活性或产生新的活性［6-7］。

血满草SambucusadnataWall.又名血莽草、接骨草，为忍冬科接骨木属多年生草本植物［8］，为我国民间常用药材，在藏族、傣族、彝族、哈尼族等少数民族中有着悠久的用药历史，也是藏药的药源植物之一，其味辛，性温，具有活血、通络的功效，可用于治疗急慢性肾炎、风湿疼痛、风疹瘙痒、慢性腰腿疼、扭伤瘀痛、骨折等［9］。血满草含有萜类、黄酮类、木质素类等多种化学成分［10-11］，但对血满草多糖化学修饰方面的相关研究未见报道。本课题组在前期研究过程中，从血满草叶片中纯化出一种均一性酸性多糖SPS-1［12］，本实验以SPS-1 为原料，开展其硫酸化、羧甲基化和硒化修饰，并比较其修饰前后免疫活性的变化情况，为SPS-1 及其衍生物的深入研究奠定基础。

1 材料

SPS-1 为实验室自制； 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、MTT 试剂购自武汉普赛诺生命科技有限公司； DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗购自美国Gibco 公司；一氧化氮检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所； 脂多糖（LPS） 购自美国Sigma 公司； IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司； 溴化钾（色谱纯） 购自天津市光复精细化工研究所；N，N-二甲基甲酰胺、氯磺酸、铬变酸、羟基乙酸、亚硒酸钠等化学试剂均为分析纯。

722N 紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）； LGJ0.5 冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）； i50 傅里叶变换红外光谱仪、Multiskan MK3 酶标仪（美国Thermo公司）； MCO-15AC CO2恒温培养箱（日本Sanyo 公司）；XS105DU 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

2 方法

2.1 硫酸化SPS-1 （SSPS-1） 制备及其取代度测定 SPS-1硫酸化修饰产物SSPS-1 的制备参照袁雷等［13］的方法进行，1 mol/L HCl 水解SSPS-1 后，采用氯化钡-明胶法［14］测定硫酸基含量，并按公式（1） 计算取代度DS。

式中：S%为硫含量。

2.2 羧甲基化SPS-1 （CSPS-1） 制备及其取代度测定 采用氢氧化钠-氯乙酸法［15］开展SPS-1 的羧甲基化修饰。称取150 mg SPS-1 样品，加入25 mL 异丙醇，搅拌30 min 后加入2.98 g NaOH，搅拌1 h，缓慢加入2.51 g 氯乙酸，60 ℃反应4 h，调pH 至中性，透析浓缩，冷冻干燥得羧甲基化多糖CSPS-1。由于SPS-1 为酸性多糖，羧基的存在对羧甲基含量测定有一定影响，因此，用0.25 mol/L NaOH 分别配制1 mg/mL SPS-1 和CSPS-1 溶液，并采用铬变酸法［16］分别测定其羧甲基的含量，并按公式（2） 计算DS。

式中：A2为每克CSPS-1 样品相当于羟基乙酸的量，A1为每克SPS-1 样品相当于羟基乙酸的量，76 为羟基乙酸摩尔质量，59 为CH2COOH 摩尔质量。

2.3 硒化SPS-1 （SeSPS-1） 制备及硒含量测定 SPS-1 的硒化修饰参照程爽等［17］的方法并稍作修改。称取SPS-1 150 mg 于烧杯中，加入25 mL 蒸馏水溶解，加入1 mL 冰醋酸，再加入溶于少量蒸馏水的150 mg 亚硒酸钠和0.65 g 氯化钡，60 ℃下搅拌反应6 h。反应结束后，滴加硫酸钠并离心除去多余Ba2＋，将上清液透析后浓缩冻干，得硒化多糖SeSPS-1。SeSPS-1 的硒含量参照李世杰［18］的方法测定。

2.4 红外光谱分析 溴化钾与适量的SPS-1、SSPS-1、CSPS-1 和SeSPS-1 混合后，压片，在4 000 ～400 cm-1波数范围内测定其红外光谱。

2.5 均一性和分子量测定 采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC） 测定SPS-1、SSPS-1、CSPS-1 和SeSPS-1 的均一性和分子量。质量浓度1 mg/mL 的SPS-1 及其衍生物溶液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后进样测定，流动相水； 体积流量1.0 mL/min； 温度25 ℃； 进样量20 μL。

2.6 免疫活性研究

2.6.1 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 培养于DMEM 培养基（含有10% 胎牛血清和100 U/mL 青霉素-100 μg/mL链霉素双抗） 中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。

2.6.2 细胞增殖率测定 采用MTT 法测定SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 对 RAW264.7 细胞增殖的影响。将RAW264.7 细胞按5.0×103个/mL 接种于96 孔细胞培养板中，加入不同质量浓度的SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1（12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL），用培养基处理的细胞作为空白对照，每组设置3 个复孔。培养24 h 后，加入10 μL MTT，37 ℃孵育4 h，吸出培养基，PBS 润洗3 遍，加入150 μL DMSO 振荡10 min，于568 nm波长处检测光密度（OD） 值。按下式（3） 计算细胞增殖率。

式中：A为样品处理组的光密度值，B为空白对照组的光密度值。

2.6.3 NO、IL-6、IL-1β、TNF-α 测定 将RAW264.7 细胞以5×105/孔的密度接种于6 孔板中，加入200、400、800 μg/mL SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1，以正常细胞为空白对照，1.0 μg/mL LPS 处理组为阳性对照，每组设置3 个复孔。培养24 h 后，收集细胞培养液，按照NO 检测试剂盒说明书检测NO 水平，按照ELISA 检测试剂盒提供的方法检测IL-6、IL-1β、TNF-α 水平。

3 结果

3.1 硫酸基、羧甲基取代度和硒含量测定 以硫酸根离子质量浓度为横坐标（X），以硫酸钾-氯化钡-明胶溶液的吸光度与硫酸钾-明胶溶液的吸光度差值为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝2.858 3X-0.022 9 （R2＝0.997 7），计算得到样品中硫酸基的质量浓度为531.25 μg/mL，硫的百分含量为8.853 3%，硫酸基DS为0.624 4。

以羟基乙酸的质量浓度为横坐标（X），570 nm 处的吸光度为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝0.000 4X-0.001 2 （R2＝0.998 9），计算得到SPS-1 和CSPS-1 中羧甲基相当于羟基乙酸的含量分别为238.00、430.50 mg/g，羧甲基DS为0.489 8。

以硒质量浓度做横坐标（X），340 nm 处的吸光度为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝0.014 1X＋0.019 （R2＝0.998 9），计算得到SeSPS-1 中硒含量为1.702 1 μg/mg。

3.2 红外光谱分析 SPS-1 及其衍生物的红外光谱图见图1。由此可知，在3 405、2 930、1 732、1 613、1 416、1 073 cm-1波数的峰，为多糖中含有的化学键伸缩、弯曲振动所致，为多糖常规吸收峰［13，19］，897 cm-1附近的峰为β-糖苷键的特征吸收峰［20］。

图1 SPS-1 及其衍生物的红外光谱图

而在SSPS-1 谱图中，1 073 cm-1处的峰减弱，同时在1 255和816 cm-1附近出现了S＝O 伸缩振动及C-O-S 拉伸振动吸收峰［21-22］，说明SPS-1 的羟基上有硫酸基团，硫酸化修饰成功。

由于SPS-1 为酸性多糖，本身含有羧基，因此在1 731.59、1 605.99、1 421.78、1 327.09 cm-1附近均有特征吸收［23-24］，对羧甲基化衍生物CSPS-1 的红外光谱分析有一定的干扰，但是通过对比分析SPS-1 和CSPS-1 的红外谱图，发现这4 个吸收峰的强度均有所增大［25-26］，说明CSPS-1 中含有羧甲基。

由图1 可知，SPS-1 经硒化修饰后，SeSPS-1 的红外光谱较SPS-1 有较大变化，说明硒化修饰对多糖结构影响较大，而亚硒酸酯的特征吸收峰不明显，仅在1 263.50、761.11 cm-1附近有较弱的吸收，说明存在少量Se-C 和Se＝O［27-28］，但硒含量较低。

3.3 均一性和分子量 SPS-1 及其衍生物的均一性和分子量结果见图2。SPS-1 的分子量为1.22×105Da。SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 的分子量分别降至8.13×104、7.82×104、8.69×104Da，表明在化学修饰过程中，由于修饰试剂的影响，多糖分子发生了不同程度的降解。由于多糖的降解，SPS-1 及其衍生物的多分散系数也增加，其中SSPS-1 的多分散系数 （PDI） 最大，达到1.76，而SPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 的PDI 分别为1.06、1.19、1.08，结果表明SPS-1及其衍生物的分子量分布仍较均匀且集中。

图2 SPS-1 及其衍生物的HPGPC 谱图

3.4 免疫活性分析

3.4.1 细胞增殖活性 由图3 可知，与空白对照组比较，不同质量浓度SPS-1 及其衍生物均可刺激RAW264.7 细胞的增殖，且随着质量浓度的增加，增殖率也随之提高。此外，SPS-1 及其衍生物在400 μg/mL 时，细胞增殖效果趋于稳定，且所选质量浓度对RAW264.7 细胞均没有细胞毒性，因此选择200、400、800 μg/mL 开展后续实验。

图3 SPS-1 及其衍生物对RAW264.7 细胞增殖的影响

3.4.2 SPS-1 及其衍生物对RAW264.7 细胞分泌NO 和细胞因子的影响 由图4 可知，与空白对照组比较，SPS-1 及其衍生物均可提高RAW264.7 细胞NO 分泌量（P＜0.05），且有剂量效应。与SPS-1 相比，SSPS-1 各质量浓度均可极显著促进NO 的分泌（P＜0.01）。CSPS-1 对NO 的促进作用与SPS-1 相比有所降低，400、800 μg/mL 时，CSPS-1 的降低效果达到了显著水平（P＜0.05）。SeSPS-1 对NO 的促进作用与SPS-1 相当，无显著性差异。

图4 SPS-1 及其衍生物对RAW264.7 细胞分泌NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影响

与空白对照组比较，SPS-1 及其衍生物均可提高RAW264.7 细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌量（P＜0.01），且有剂量效应。与SPS-1 比较，各质量浓度SSPS-1 均可促进IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌。CSPS-1 对IL-1β、IL-6 和TNF-α 的促进作用与SPS-1 相比均有显著降低。SeSPS-1 对IL-1β、IL-6、TNF-α 的促进作用与SPS-1 基本相当，在200和400 μg/mL 时，可显著促进IL-1β 的分泌，800 μg/mL时，可显著降低IL-6 和TNF-α 的分泌。

与阳性对照组比较，SPS-1 及其衍生物对RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 产生显著影响 （P＜0.01），但仍未达到LPS 的激活水平。

4 讨论

硫酸化、羧甲基化和硒化修饰是比较常见的多糖化学修饰方法，这3 种化学修饰对多糖的结构和免疫活性均产生一定的影响。硫酸化修饰的青钱柳多糖能显著增加RAW264.7 细胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌水平，可显著增强RAW264.7 细胞的NO 释放和吞噬活性，表明硫酸化修饰可增强多糖的免疫调节作用［29］。羧甲基修饰的大粒车前子多糖能够使树突状细胞分泌细胞因子IL-12 p70 显著增加，表现出更好的体外免疫活性［30］。通过分析9 种硒化太子参多糖 （ sRPP1、sRPP2、sRPP3、sRPP4、sRPP5、sRPP6、sRPP7、sRPP8 和sRPP9） 和太子参多糖（RPP）的免疫活性，发现sRPP2、sRPP3、sRPP8 和sRPP9 对RAW264.7 细胞的增殖作用显著高于RPP，其中sRPP8 和sRPP9 对RAW264.7 细胞分泌NO、IL-6 和TNF-α 的促进作用显著高于RPP［31］。

本实验从血满草酸性多糖SPS-1 出发，通过化学修饰合成了SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1，通过计算硫酸基、羧甲基和硒的含量及其红外光谱特征吸收峰的分析，明确了SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1 中分别含有硫酸基、羧甲基和硒。HPGPC 结果显示化学修饰导致多糖产生部分降解，但均一性仍较好。细胞实验结果表明，SPS-1、SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1 均可显著促进RAW264.7 细胞的增殖，且可显著促进RAW264.7 细胞分泌NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α，与SPS-1 相比，SSPS-1 对NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 释放作用更加明显，SeSPS-1 与之基本相当，CSSPS-1 对NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 释放作用显著降低，说明3种化学修饰对SPS-1 免疫活性的影响较大。本实验可为多糖的构效关系研究提供参考，并为深入开展血满草多糖及其衍生物的免疫活性研究奠定基础。