直投式酵母菌发酵对江蓠腥味及膳食纤维性质的影响

木尼热·卡地尔，姚沅俊，蔡真珍，蔡宁，姜泽东，4，郑明静，4，杜希萍，4，倪辉，，4*

（1.集美大学 海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.厦门海洋职业技术学院，福建 厦门 361102；4.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

海藻是海带、紫菜、江蓠等海洋藻类的总称，其养殖地主要分布在我国福建、山东、广东、海南等东南沿海地区。其中，福建省是我国海藻大省，由《2020 中国渔业统计年鉴》可知，2020 年福建省海藻产量高达12 万t，约占全国海藻产量的48%[1]。海藻中富含藻胶、纤维素和半纤维素等，是制备膳食纤维的优质原料[2]。海藻膳食纤维作为从海洋藻类中提取的一种天然膳食纤维，具有一定的持水性、持油性及凝胶强度等特性[3]，主要作为增稠、稳定用途的食品配料。但是，碳氢化合物、酮、醛、醇、羧酸、酯等挥发性化合物构成了海藻中广泛的挥发性代谢物[4]，直接采用海藻制备膳食纤维具有较浓烈的腥味，影响其在下游加工产品中的应用。因此，对海藻进行脱腥处理是提高其膳食纤维品质的重要研究内容。

脱除腥味的方法主要有物理法、化学法及生物法[5]。张丽君等[6]研究发现，活性炭及β-环状糊精对螺旋藻吸附脱腥效果不明显；加热法则会引起严重变色及沉淀产生。潘江球等[7]研究发现，用碱法进行脱腥会导致江蓠营养成分严重损失。杨超[8]研究发现，利用微生物发酵不仅可以有效脱除龙须菜腥味，而且还可以改善其风味。与物理和化学脱腥法相比，生物法脱腥不需要长时间的热处理，且不引入外源化学物质，是一种绿色的脱腥方法。传统食品发酵方法是采用微生物扩大培养的方式，近年来，直投式微生物发酵剂越来越广泛地用于增强食品风味[9]，为简化发酵脱腥工艺提供了方便的途径。

酵母菌是常用的发酵脱腥微生物。相关研究表明，酵母菌体内的醇脱氢酶、醛脱氢酶能将醛类以及烯醛类等腥味物质氧化或还原成风味较柔和的醇和酸，使用酵母菌发酵能有效地降低水产品的腥味[10]。刘豪等[11]用安琪高活性干酵母对小麦麸皮进行发酵，发酵后麸皮的蛋白质及灰分含量、持水性、溶胀性均增强。研究表明，酵母菌的代谢反应不仅可将腥味成分转化成无腥味的成分，也可能对脂肪、蛋白质和多糖等成分具有转化作用。因此，在研究酵母菌发酵去除海藻腥味的同时，也要关注其发酵脱腥对海藻膳食纤维相关性质的影响。

目前，已有关于腥味及海藻膳食纤维相关性质的研究。例如，腥味不仅可借助人嗅觉器官感知腥味的强度，还可以通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）及电子鼻（electronic nose，E-Nose）等方法进行测定[12-13]。膳食纤维的持水性、持油性等理化性质通常采用离心前后的质量比来评价，凝胶强度则用质构仪进行测定[14]。这些有关海藻腥味分析检测及海藻膳食纤维应用性质分析检测方法为深入研究发酵对海藻腥味及其膳食纤维性质的影响提供参考。

江蓠（Gracilaria）是我国一种重要的经济类海藻，其膳食纤维含量高达80%～90%[7]。研究显示，江蓠藻膳食纤维能显著降低高血脂模型小鼠血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量及肝脏脂质水平，还能降低高脂膳食导致的氧化损伤[15]。用传统方法制备的江蓠膳食纤维具有较强烈的腥味，目前尚未开展膳食纤维脱腥的研究。因此，本研究以江蓠为原料，运用感官检验和固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，SPME-GC-MS）技术，研究直投式酵母菌发酵对江蓠腥味的影响，同时，基于仪器分析评价酵母菌发酵对江蓠腥味及其膳食纤维持水性、持油性、凝胶强度等应用性质的影响。本研究可为江蓠膳食纤维的生产奠定技术基础，同时还为其他海藻脱腥及其膳食纤维加工提供参考，对提高江蓠及其他海藻的价值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

江蓠：绿新（福建）食品有限公司；直投式安琪耐高温酿酒高活性干酵母：河南洲洋生物科技有限公司；白砂糖：市售；乙醇、3-己酮、C8-C20、柠檬烯、4-萜品醇、2-辛烯-1-醇、香茅醛、肉豆蔻酸异丙酯、异植物醇、橙花醇、顺，顺-2，4-壬二烯醛、苯甲醇、2，4-二甲基苯甲醛、柠檬醛、2，4-二叔丁基苯酚、芳樟醇、1-辛烯-3 醇、邻苯二甲酸二丁酯、十一醛、柏木脑、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸甲酯、反-2-癸烯醛、反-2-壬醛、邻苯二甲醚、2-乙基己醇、反-2-辛烯醛、苯乙酮、2，4，6-三甲基吡啶、茴香脑、癸醛、顺-香叶基丙酮、壬醛（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器设备

ZSBB-712 电热恒温水浴箱、ZXRD-B5110 恒温鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；FW100高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；GL1241-1SCN 电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TA-TOUCH 质构仪：上海保圣实业发展有限公司；SX2-12-10 箱式电阻炉：济南精密科学仪器仪表有限公司；MB25 水分测定仪：奥豪斯仪器（苏州）有限公司；DL-1 电子调温电炉：江阴保利科研器械有限公司；H2050R 台式高速大容量冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；WSB-2 数显白度仪：河北慧采科技有限公司；QP-2010Plus 气相色谱质谱串联仪：日本岛津公司；Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25µm）色谱柱：美国色谱科公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌的活化

取1 g 直投式安琪耐高温酿酒高活性干酵母，加至1 000 mL 灭菌的3% 白糖溶液中，混合均匀，密封后置于室温活化10 h，分别用无菌水稀释至一定的比例备用。

1.3.2 发酵江蓠样品的制备

采用一定条件进行发酵后，滤除酵母菌液，藻体用40 倍的自来水清洗3 次，滤干后在60 ℃干燥12 h，粉碎过40 目筛，制备江蓠粉备用。以未发酵样品作为空白对照。

1.3.3 酵母发酵工艺参数对江蓠腥味的影响

1.3.3.1 发酵温度对脱腥效果的影响

准确称取20 g 江蓠藻（用15～20 倍藻体积清水清洗，除去掺杂在江蓠藻中的泥沙、碎壳等杂质）于500 mL 锥形瓶中，按料液比1∶15（g/mL）、菌液稀释4 倍的条件进行混合，密封后分别置于15、20、25、30、35 ℃电热恒温水浴箱中，发酵4 h 后进行感官评价（腥味强度）。

1.3.3.2 菌液稀释倍数对脱腥效果的影响

准确称取20 g 江蓠藻（用15～20 倍藻体积清水清洗，除去掺杂在江蓠藻中的泥沙、碎壳等杂质）于500 mL 锥形瓶中，按料液比为1∶15（g/mL）、菌液稀释1、2、4、8、16 倍的条件进行混合，密封后置于25 ℃电热恒温水浴箱中，发酵4 h 后进行感官评价（腥味强度）。

1.3.3.3 料液比对脱腥效果的影响

准确称取20 g 江蓠藻（用15～20 倍藻体积清水清洗，除去掺杂在江蓠藻中的泥沙、碎壳等杂质）于500 mL 锥形瓶中，按菌液稀释4 倍、料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）的条件进行混合，密封后置于25 ℃电热恒温水浴箱中，发酵4 h 后进行感官评价（腥味强度）。

1.3.3.4 发酵时间对脱腥效果的影响

准确称取20 g 江蓠藻（用15～20 倍藻体积清水清洗，除去掺杂在江蓠藻中的泥沙、碎壳等杂质）于500 mL 锥形瓶中，按料液比1∶15（g/mL）、菌液稀释4 倍的条件进行混合，密封后置于25 ℃电热恒温水浴箱中，分别发酵0、2、4、6、8 h，待发酵完成后进行感官评价（腥味强度）。

1.3.4 发酵对江蓠腥味成分的影响

取20 mL 超纯水于45 mL 萃取瓶中，加入5 g 发酵处理后的江蓠，再加入10µL 1 mg/mL 的3-己酮作为内标物，拧紧瓶盖，摇匀，置于60 ℃电热恒温水浴箱中平衡30 min。采用老化后的65µm DVB/CAR/PDMS的萃取头吸附30 min，进行GC-MS 分析。每组样品处理设5 次平行。未经发酵处理的江蓠作为空白对照。

1.3.5 发酵对江蓠膳食纤维应用性质的影响

1.3.5.1 白度的测定

利用白度仪测定江蓠粉的白度。仪器调好后，将待测的江蓠粉放在试样座上进行测定，待显示值稳定后便即可记下其白度值。每组样品做3 次平行，结果取平均值。

1.3.5.2 持水性的测定

参考吴兴雨等[16]的方法，略微修改，取0.5 g 江蓠粉，加入10 mL 蒸馏水，充分振荡，4 000 r/min 离心30 min，弃去上清液，称量离心后沉淀的质量，按公式（1）计算持水性。

式中：h1为江蓠粉持水性，g/g；m0为江蓠粉初始质量，g；m1为离心后沉淀的质量，g。

1.3.5.3 持油性的测定

参考吴兴雨等[16]的方法，略微修改，取0.5 g 江蓠粉，加入10 mL 玉米油，充分振荡，4 000 r/min 离心30 min，弃去上清液，称量离心后沉淀的质量，按公式（2）计算持油性。

式中：h2为江蓠粉持油性，g/g；m0为江蓠粉初始质量，g；m2为离心后沉淀的质量，g。

1.3.5.4 凝胶强度的测定

参照GB 1886.239—2016《食品安全国家标准食品添加剂琼脂》[17]中1.5% 琼脂（干基计）凝胶试样制备的方法，根据上述测得的江蓠粉的水分含量，按公式（3）计算出称取样品量。

式中：X为称取试样质量，g；D为试样水分的质量分数，%。

准确称取由公式（3）计算所得到的样品0.001 g，置于500 mL 锥形瓶中，加入100 mL 水，静置浸泡1 h后，微沸加热直至试样出现胶着状态，将胶着液平均倒入100 mL 烧杯中，冷却至胶体形成，用保鲜膜密封，室温放置15 h 备用。利用质构仪测定其凝胶强度。参考王鑫等[18]的研究方法，采用P/0.5 探头，测试前、中、后速度分别为1、1、1 mm/s，触发力5 g，压入凝胶中心位置4 mm。

1.3.6 腥味的感官评价

采用感官评分法，对发酵后的江蓠整体气味可接受程度进行评分。通过阅读大量文献及预试验选择了腥味参照物质，选择10 名（男5 名，女5 名）食品专业学生作为评审人员，对不同浓度梯度的腥味标准溶液进行培训，使评审人员熟悉腥味强度的定量感官评价方法，再按照表1 所示的评分描述进行感官评价。

表1 发酵脱腥效果评分标准Table 1 Scoring criteria for the effect of fermentation on reducing fishy odor

1.3.7 腥味成分的GC-MS 挥发性成分测定

色谱条件：Rtx-5MS 石英毛细柱（60 m×0.32 mm×0.25µm）；进样口温度为230 ℃；最初温度为40 ℃并保持0 min，以1 ℃/min 升温至57 ℃，在57 ℃保持0 min，再以5 ℃/min 升温至230 ℃，在230 ℃保持5 min。用高纯氦气（纯度99.999%）作为载气，柱流量为3.16 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源；电子能量为70 eV；离子源温度为220 ℃；接口温度为250 ℃；通过选择扫描模式进行定性分析，质量扫描范围m/z 35～500。溶剂延迟时间为3 min。

定性定量分析：运用质谱数据库（NIST11、NIST11s、FFNSC1.3）进行相似度检索，根据不同物质的基峰、质荷比和相对峰度做串连检索与人工解析，质谱匹配度大于80% 作为物质鉴定标准；按公式（4）计算待测组分的保留指数（retention index，RIx），与文献报道的保留指数进行对比定性。

式中：R为待测定成分的保留指数；ti为待测成分i的调整保留时间，min；tn为具有n个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，min；tn+1为具有n+1 个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，min。

此外，采用面积归一法进行定量，按公式（5）计算各组分百分含量。

式中：Xi为组分i的百分含量，%；A1、A2…Ai为组分1、2…i的峰面积；f1、f2…fi为组分1、2…i的相对校正因子。

1.4 数据处理

采用Excel 2017 对江蓠脱腥工艺及其挥发性成分进行定性、定量等统计分析，并绘制相关图表；利用IBM SPSS 26.0 对试验数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 直投式酵母菌发酵工艺对江蓠腥味的影响

直投式酵母菌发酵工艺参数对江蓠腥味的影响如图1 所示。

图1 直投式酵母菌发酵工艺参数对江蓠腥味的影响Fig.1 The effects of directed vat set yeast fermentation parameters on fishy odor of Gracilaria

由图1A 可知，腥味强度随发酵温度的升高先降低后升高，当发酵温度为25 ℃时，腥味强度最低。由图1B 可知，腥味强度随菌液稀释倍数增加呈先下降后上升的趋势，当活化菌液稀释倍数为4 时，腥味最淡。由图1C 可知，腥味强度随溶剂添加量的增加先降低后升高，当料液比为1∶20（g/mL）时腥味强度最低。由图1D 可知，随着发酵时间的延长，腥味强度呈先下降后上升的趋势，当发酵至4 h 时，腥味强度最低。相关研究表明，发酵时间、菌液稀释倍数、料液比以及发酵温度是影响酵母菌发酵的主要因素，发酵温度过高或者过低都会对酵母菌活性造成一定的影响，从而影响其最终的脱腥效果[19]。顾赛麒等[5]研究表明脱除海带腥味时酵母菌发酵温度在25 ℃左右较适宜。本研究的发酵温度条件与文献[5]的研究结果相似，但活化菌液稀释倍数、料液比及发酵时间存在差异，其主要原因是发酵的藻类原料不同。

2.2 发酵对江蓠挥发性成分的影响

GC-MS 分析结果如表2 所示。

表2 发酵前后江蓠挥发性化合物定性定量结果Table 2 Qualitative and quantitative results of volatile compounds before and after fermentation

由表2 可知，未经脱腥的江蓠样品中共鉴定出7大类37 种挥发性成分，其中醇类8 种、烯烃1 种、醛类15 种、酮类3 种、酯类5 种、醚类1 种、其他类4 种；发酵脱腥的江蓠样品中共鉴定出6 大类40 种挥发性成分，其中醇类12 种、醛类13 种、酮类4 种、酯类4 种、醚类1 种、其他类6 种。江蓠空白对照样品的挥发性成分中，醇类主要有1-辛烯-3-醇（10.83%）、2-乙基己醇（25.78%），导致腥味的醛类主要有正己醛（21.83%）、（Z）-2-辛烯醛（56.86%）、（Z）-4-癸烯醛（10.57%）、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛（46.97%），酮类主要有植酮（101.12%）。江蓠经过发酵后，醇类、醛类和酮类物质明显减少，烯烃类和其他类物质明显增多。相关研究表明，醛类、醇类化合物气味阈值一般较低，通常会产生一些令人不愉快、辛辣的刺激性气味，其中正己醛、2-辛烯醛、（Z）-4-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇等是腥味的主要贡献者[20-22]。未发酵的江蓠含有一定量的1-辛烯-3-醇、正己醛、（Z）-2-癸烯醛、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛和（Z）-4-癸烯醛，这些成分主要呈现腥味，可能是构成江蓠腥味的主要物质。酵母菌发酵后，正己醛未检出，1-辛烯-3-醇由10.83%降至5.35%、（Z）-4-癸烯醛由10.57%降至3.92%、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛由46.97% 降至12.13%。通过对比发现，经过发酵处理后，江蓠中的腥味成分大幅度降低，其中正己醛脱除率为100%，1-辛烯-3-醇降低率达51%，（Z）-4-癸烯醛降低率为63%，（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛降低率为74%，（Z）-2-辛烯醛降低率为13%，该结果与顾赛麒等[5]研究结果相似。此外，L-薄荷醇由0%增至6.95%，（E）-5-十二烯-1-醇由0%增至7.39%，（E）-香叶基丙酮由50.42% 增为60.94%。相关文献报道，L-薄荷醇和（E）-5-十二烯-1-醇主要呈柑橘香和薄荷香，（E）-香叶基丙酮主要呈玫瑰花香[23]。根据Xu 等[24]研究结果，酿酒酵母发酵脱腥是在还原型辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）/还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的前提下，烯酮还原酶、醛酮还原酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、环氧化物水解酶等催化发生醛、醇类的氧化还原反应、醚的分解以及酯化合成反应，将腥味成分转化成无腥味的成分。以上研究结果说明，发酵后江蓠腥味的降低可能与其腥味成分大幅度降低有关，但也可能与其花香成分增加有关，其生化反应过程可能与酶催化的醛醇氧化还原反应、醚分解以及酯化合成反应相关。

2.3 发酵脱腥对江蓠粉应用性质的影响

发酵脱腥对江蓠粉应用性质的影响见表3。

表3 发酵脱腥前后江蓠粉理化性质对比Table 3 Comparison of physicochemical properties before and after fermentation

由表3 可以看出，经过发酵脱腥处理的江蓠样品，腥味强度明显降低，持水性、持油性、白度和凝胶强度有轻微变化。研究表明，膳食纤维多糖链能够形成多孔结构，其大量亲水基团可通过氢键作用来吸收和保持水分[25]。同时，膳食纤维结构上含有大量的疏水亲油基团，使其具有良好的持油能力。此外，白度和凝胶强度对膳食纤维的应用也具有重要影响[26-27]。研究显示，持水能力高的膳食纤维可以锁定食品中更多水分，稳定食品的形态，减少焙烤类制品因脱水而引起的皱缩[28-29]。在酵母菌发酵过程中，江蓠粉的比表面积和亲水基团增加，从而使其持水性提高。研究表明，高持油性的膳食纤维可以防止烹饪过程中脂肪流失，显著改善食品的风味和口感，并使高脂食品更稳定，有助于延长保质期[30]。

3 结论

以江蓠为原料，研究直投式酵母菌发酵对海藻腥味强度、腥味成分、膳食纤维持水性、持油性、凝胶强度等应用性质的影响。结果表明，直投式酵母菌在发酵温度25 ℃、菌液稀释4 倍、江蓠与稀释菌液比例1∶20（g/mL）、发酵时间4 h 条件下具有良好的发酵脱腥效果。酵母菌发酵后，江蓠样品的腥味强度评分由2.28上升至9.67，腥味成分正己醛、1-辛烯-3-醇、（Z）-4-癸烯醛、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛明显下降，持水性、持油性、白度及凝胶强度变化很小。本研究可为江蓠的脱腥及其膳食纤维的生产奠定技术基础，还为其他海藻脱腥及其膳食纤维加工提供参考，对提高江蓠的加工利用价值具有重要参考意义。