积雪草酸对实验性蛛网膜下腔出血大鼠脑损伤的保护作用

2024-04-01 10:57武潇潇胡玉鲲吴江
天津医药 2024年3期
关键词:蛛网膜下腔出血脑损伤

武潇潇 胡玉鲲 吴江

摘要:目的 探討积雪草酸(AA)对实验性蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠脑损伤的神经保护作用。方法 将108只成年SD大鼠分为假手术(Sham)1组、SAH+Vehicle(空载)组与SAH+AA组,每组36只;42只大鼠分为Sham2组及SAH后3、6、12、24、48、72 h组,每组6只。除Sham组外,其余各组采用单侧颈外动脉线刺法建立SAH模型,造模后SAH+AA组灌胃AA溶液(30 mg/kg)。采用踏空实验和改良Garcia评分评估神经行为学改变,Western blot检测脑组织谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达,酶联免疫吸附试验检测脑组织谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)浓度,Fluoro-Jade B染色检测神经元死亡情况。结果 与Sham1组相比,SAH+Vehicle组踏空步数比例明显增多且改良Garcia评分明显降低,脑组织GPX4蛋白表达水平和GSH含量降低,MDA含量升高,死亡神经元数目增多(均P<0.05)。与SAH+Vehicle组相比,SAH+AA组踏空步数比例下降且改良Garcia评分升高,脑组织GPX4蛋白表达升高,MDA含量下降,GSH含量升高,死亡神经元数目明显下降(P<0.05)。结论 AA可能通过抑制脂质过氧化减轻大鼠SAH后的脑损伤。

关键词:积雪草酸;脂质过氧化;蛛网膜下腔出血;脑损伤

中图分类号:R743.35文献标志码:ADOI:10.11958/20231956

Protective effect of asiatic acid on brain injury after experimental subarachnoid

hemorrhage in rats

WU Xiaoxiao1, HU Yukun2, WU Jiang3△

1 Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, China; 2 the Affiliated Changshu Hospital of Nantong University; 3 the First Affiliated Hospital of Soochow University

△Corresponding Author E-mail: szjiangwu@163.com

Abstract: Objective To explore the neuroprotective effect of asiatic acid (AA) on brain damage after experimental subarachnoid hemorrhage (SAH) in rats. Methods A total of 108 adult SD rats were divided into the sham1 group, the SAH+vehicle group and the SAH+AA group, with 36 rats in each group. The 42 rats were divided into the sham2 group, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 h after SAH groups, with 6 rats in each group. Except the sham group, SAH model was established by unilateral external carotid artery puncture method in other groups. After modeling, the SAH+AA group was given AA solution (30 mg/kg) by gavage. Neurobehavioral changes were assessed by foot fault test and modified Garcia score. Western blot assay was used to detect the protein level of glutathione peroxidase 4 (GPX4) in brain tissue. ELISA was used to detect the concentrations of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA). Fluoro Jade B (FJB) staining was used to detect the neuronal death. Results Compared with the sham1 group, the SAH+vehicle group showed a significant increase in the proportion of empty steps and a significant decrease in the modified Garcia score, a significant decrease in GPX4 protein levels, a significant increase in MDA concentration (P<0.05), a decrease in GSH concentration (P<0.01) and a significant increase in the number of dead neurons (P<0.05). Compared with the SAH+vehicle group, a significant decrease in the proportion of empty steps, a significant increase in the modified Garcia score, a significant increase in GPX4 protein level, a significant decrease in MDA concentration, a significant increase in GSH concentration (P<0.05) and a significant decrease in the number of dead neurons in the SAH+AA group (P<0.05). Conclusion AA may reduce brain injury after SAH in rats by inhibiting lipid peroxidation.

Key words: asiatic acid; lipid peroxidation; subarachnoid hemorrhage; brain damage

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是出血性脑卒中的主要形式之一,也是一种致死致残率高的神经外科急重症[1-2]。目前已有大量实验研究证实SAH后神经损伤与氧化应激有关,是导致预后不良的主要病理改变[3-5]。积雪草酸(asiatic acid,AA)是热带植物积雪草中天然存在的五环三萜类化合物,具有强大的抗氧化和抗炎等广泛的生物活性[6-7]。已有研究证实,AA可以穿透血脑屏障,并在脑梗死等神经系统疾病中发挥神经保护作用[5,8]。本研究旨在探讨AA在SAH中的神经保护作用及可能机制,为改善SAH患者预后提供潜在的治疗途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 150只SPF级成年健康雄性SD大鼠,8~10周龄,体质量280~330 g,购自昭衍新药研究中心有限公司,动物生产许可证号:SCXK(苏)2023-0004。大鼠以常规棒状颗粒饲料喂养,自由饮水,定期更换饲料,清理鼠笼,动物房温度18~22 ℃,维持昼夜循环。本研究过程中动物的使用符合《国家实验动物饲养和使用指南》的相关规定,实验及操作经过苏州大学附属第一医院医学伦理会批准(编号:2021伦审批第124号)。

1.1.2 主要试剂和仪器 AA(纯度98.23%)购自Aktin Chemicals公司,二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司,兔抗鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase,GPX4)抗体(DF 6701)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(AF 7021)购自Affinity公司,抗兔IgG抗体(7074S)购自Cell Signaling公司,丙二醛(MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自同仁化学公司,谷胱甘肽(GSH)ELISA检测试剂盒购自BioVision公司,Western blot相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司,Fluoro-Jade B(FJB)粉末购自Biosensis公司。光学显微镜(SMZ745型)、荧光显微镜(DS-Ri2型)购自日本Nikon公司,多功能酶标仪(DR-200Bn型)购自无锡华卫德朗仪器有限公司。溶液配制:空载溶液为50 mL生理盐水+50 μL DMSO,AA溶液为50 mL生理盐水+50 μL DMSO+150 mg AA粉末。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及大鼠SAH模型的建立 大鼠喂养1~2周后按照随机数字表法将108只大鼠分为假手术(Sham)1组、SAH+Vehicle组(溶剂对照)、SAH+AA组(给药),每组36只。剩余42只分为Sham2组及SAH后3、6、12、24、48、72 h组,每组6只。除Sham组外,其余组均采用单侧颈外动脉线刺法构建SAH模型。术前8 h禁食,称体质量后,使用4%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉。常规消毒备皮后将大鼠固定在动物实验台上,在颈部做纵向切口,分离肌肉和筋膜,暴露颈外动脉。头侧解剖并结扎颈外动脉远端,继续解剖并暴露颈总动脉和颈内动脉。悬吊颈内动脉以暂时阻断血流,用动脉夹夹住远端颈总动脉以阻断血流。用显微剪刀在颈外动脉残端上剪开一个破口,然后沿着破口插入线栓,直到栓线标记处到达颈内外动脉分叉口处再向内行进0.5~1.0 cm,直至感觉到突破;5 s后,拔出线栓,结扎颈外动脉残端,松开颈总动脉的动脉夹。观察血管的再灌注情况。缝合切口并进行术后护理[9]。Sham组仅结扎颈外动脉远端。

1.2.2 干预时间及给药方式 (1)干预时间:将Sham2组及SAH后3、6、12、24、48、72 h组的42只大鼠麻醉后处死,用150 mL PBS灌注心脏后完整取出脑组织,取颞底脑组织,置入IP细胞裂解液中充分裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min,分离上清液,使用BCA检测试剂盒测量上清液中蛋白质含量并平衡浓度。平衡后的样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜。封闭液封闭60 min,添加GPX4一抗(1∶1 000),在4 ℃孵育过夜。次日用PBST冲洗3次,添加抗兔IgG二抗(1∶2 000),在室温下孵育60 min。最后在显影仪上用增强化学发光法曝光,Image J软件测量目的条带的灰度值并计算GPX4蛋白相对表达量[10]。根据GPX4表达水平确定SAH后取材时间。

(2)给药方式:SAH+AA组大鼠在造模后按照30 mg/kg剂量[11]灌胃AA溶液(参与行为学实验大鼠在SAH后3 h给药,每隔24 h给药1次,共3次,其余实验大鼠在SAH后3 h给药,隔12 h给药1次,共2次)。SAH+Vehicle组在大鼠SAH造模3 h后通过灌胃给药,根据AA需要量计算相应计量给予空载溶液。Sham1组不予处理。

1.2.3 踏空实验 将大鼠置于升高的网格铁架上,网格大小为6 cm×6 cm。大鼠把爪子放在铁丝上,沿着格子移动。为了便于记录步态,从格子下方对大鼠进行录像。当神经受损的前肢负重时,可能会掉落到铁丝之间,即为踏空[12]。记录左侧前爪的踏空步数和总步数,计算踏空比例。大鼠于造模前3 d进行训练,每天3次,每次录像1 min,取平均值作为术前基础值。在建模后的第3、5、7、14天,每组取12只大鼠进行测试。

1.2.4 改良Garcia评分 大鼠于建模前1 d进行评分,每只大鼠测评3次,取平均值作为基线水平,在建模后第3、5、7天,每组取12只大鼠进行评估。改良Garcia评分用于评估SAH后大鼠的身体本体感觉、攀爬、前肢运动、触须侧转、肢体对称性以及自主运动6项,每项0~3分,总分18分;評分越高,代表神经功能越好[13]。

1.2.5 Western blot 各组取6只大鼠,在SAH后24 h处死,PBS灌注心脏后完整取出脑组织,参照1.2.2中步骤检测脑组织中GPX4表达。

1.2.6 脑组织Fluoro-Jade B(FJB)染色 各组取6只大鼠在SAH后24 h处死,PBS及4%多聚甲醛灌注心脏后完整取出脑组织,取含有颞底的整块脑组织制成石蜡切片。切片在70 ℃的烘箱中放置1 h,然后用二甲苯和乙醇水溶液对切片进行脱蜡。将切片置入0.06%的高锰酸钾溶液中15 min,然后用去离子水冲洗2 min,再浸入FJB工作液(0.1%乙酸)中浸泡30 min。然后将切片在50~60 ℃烘烤15 min,二甲苯透明,中性树胶封片。荧光显微镜下采用蓝色激发光(波长为450~490 nm)观察及图像采集[14],计数死亡神经元数量。

1.2.7 ELISA检测脑组织中MDA及GSH含量 各组取6只大鼠,在SAH后24 h处死,用PBS灌注心脏完整取出脑组织,PBS冲洗,每组取20 mg颞底脑组织采用微量板酶标法MDA的含量,根据检测试剂盒说明进行操作;同上方法处死大鼠后,取100 mg颞底脑组织,采用微量板酶标法检测GSH的含量,根据检测试剂盒说明进行操作。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以[x] ±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,SAH后不同时点指标比较采用重复测量资料的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AA可提高大鼠SAH后行为学表现 与Sham1组相比,SAH+Vehicle组SAH后各时点踏空步数比例增多,改良Garcia评分降低(P<0.05),与SAH+Vehicle组相比,SAH+AA组踏空步数比例下降,改良Garcia评分升高(P<0.05),见表1、2。

2.2 SAH后脑组织中GPX4表达水平降低 Western blot结果显示,与Sham2组相比,SAH后24 h脑组织中GPX4蛋白表达明显下降,其他时间点差异无统計学意义,见图1。故选择SAH后24 h作为后续实验的取材时间点。

2.3 AA能够减少神经元死亡 见图2。FJB染色结果显示,Sham1组、SAH+Vehicle组、SAH+AA组变性神经元数量分别为(0.67±0.82)、(10.83±1.17)和(7.17±1.17)个/mm2,差异有统计学意义(n=6,F=140.300,P<0.01)。SAH+Vehicle组变性神经元数目较Sham1组增多(P<0.05),而相比SAH+Vehicle组,SAH+AA组中变性神经元出现减少(P<0.05)。

2.4 AA对脂质过氧化蛋白表达的影响 与Sham1组相比,SAH+Vehicle组大鼠脑组织中GPX4蛋白相对表达量和GSH含量降低,MDA含量升高(P<0.05)。与SAH+Vehicle组相比,SAH+AA组GPX4蛋白相对表达量和GSH含量升高,MDA含量下降(P<0.05),见图3、表3。

3 讨论

SAH是出血性脑卒中的一种致命亚型,它通常由颅内动脉瘤破裂导致[15]。目前已有大量针对SAH后神经损伤机制的研究,但是具体干预机制以及有效的治疗手段仍然相对有限[16]。AA作为天然植物中存在的成分,具有抗氧化、保护神经的功能[10,17]。研究发现AA可明显改善缺血性卒中后脑损伤[12]。因此,笔者推测AA可能对SAH同样具有神经保护作用。本研究通过在大鼠SAH后给予AA进行药物干预,观察其在改良Garcia评分、踏空实验等行为学测试中的表现,发现AA可有效改善大鼠SAH后的神经行为学功能损伤。本研究同时观察到AA能够有效减少SAH大鼠神经元的死亡,为SAH后脑损伤的治疗提供了一种新型的药物治疗思路。

研究已经表明,许多神经系统疾病中均有脂质过氧化的出现,并且对于调控神经元死亡具有重要作用[18],其中GSH、MDA以及GPX4则是脂质过氧化的重要标志物[19-20]。本研究发现,在SAH 24 h后大鼠脑组织中GPX4的含量明显下降,这也印证了SAH后脂质过氧化的发生。本研究进一步发现SAH后大鼠脑组织中MDA含量增加,GSH含量下降,确证了SAH后脂质过氧化的发生及其下游产物的堆积。给予AA干预后,脑组织GPX4及GSH的含量较前得到提升,MDA含量下降,死亡神经元数量减少,提示AA可能通过抑制脂质过氧化来减少大鼠SAH后神经元死亡,发挥神经保护作用。本研究探究了AA在SAH中的作用,为SAH后的治疗提供了新的思路方法。但本研究中尚存在着一些局限性,如仅简单验证了AA在大鼠SAH后的神经保护作用,具体的靶向蛋白及下游机制通路尚不明确;另外,GSH的耗竭、GPX4的失活以及MDA的堆积虽然是脂质过氧化发生过程中重要的一环,但根据上述指标的变化尚不能直接表明脂质过氧化的变化情况,疗效证据不足;再者,AA是否通过脂质过氧化以外的其他信号通路来改善大鼠SAH后神经损伤还需进一步明确。

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(2023-12-10收稿 2023-12-25修回)

(本文编辑 胡小宁)

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