女贞不同部位总黄酮含量对比及其抗氧化性能研究

■ 徐瑞芳

（新乡医学院三全学院，河南 新乡 453003）

女贞树简称女贞（Ligustrum lucidumAit.），木犀科常绿植物，分布于华东、华南、西南及华中各地。女贞子（Fructus ligustri lucidi）为木犀科植物女贞的果实，具有补腰膝、壮筋骨、乌须发等作用，作为中药应用已有2 000 多年[1-3]。女贞子化学成分丰富，主要包含萜类、黄酮类、挥发油及多糖等成分，其中黄酮类化合物（Flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物[4-6]。研究表明，女贞子及其提取物应用于畜禽生产中，具有提高生产性能、抗氧化、提高免疫力、促进脂类代谢、抑菌抗炎、改善畜禽产品品质等功能[7-9]。

黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，能够抑制和清除动物机体内的不良自由基（主要来自酶促反应或非酶促反应），在生物系统中具有保护功能[10-12]。研究表明，黄酮类化合物有抗氧化、抗微生物、提高免疫力、抗炎抑菌、降血糖、调节脂质代谢和抗癌等药理作用[13-15]；可以促进动物生长发育、提高动物产品质量，因此在动物生产中被广泛用作饲料添加剂[16-18]。

女贞子在我国分布广泛、资源多、价格低，它作为饲料添加剂具备无残留、无抗药性等特点[19]。女贞中的黄酮类物质是女贞发挥药理活性的重要成分，其含量是鉴别评价女贞质量的标志物之一[20-21]。女贞总黄酮的研究多在女贞子黄酮含量测定及提取工艺方面，关于女贞不同部位黄酮的含量及活性是否有差异报道较少。试验选取女贞树的茎、叶、果实作为研究材料，采用超声波提取总黄酮，并以其总还原能力、清除DPPH·和ABTS+·的能力来评价其抗氧化活性，研究女贞树各部位总黄酮含量与抗氧化活性，为女贞树资源的充分开发利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）采于新乡医学院三全学院内（2022 年9 月份，采集植株30 棵），并另采取女贞子（紫果）（2022 年12 月份，采样植株同9月份）。

芦丁，≥98%，上海源叶生物科技有限公司；抗坏血酸（VC），分析纯，天津市大茂化学试剂厂；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），96%，上海易恩化学技术有限公司；2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐（ABTS），98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等其他试剂均为分析纯。

XFB型中药粉碎机，湖南中诚制药机械厂；101型电热鼓风干燥箱，上海科恒实业发展有限公司；BSA224S 分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；SHZ-DⅢ循环水式多用真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司；TD4 低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；R206 旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；UV-1600 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器有限公司。

1.2 总黄酮标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品0.02 g，用无水甲醇溶解定容于100 mL 容量瓶制备0.2 mg/mL 芦丁对照品溶液。取芦丁对照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 到7 个洁净的10 mL 容量瓶中，用50%的乙醇补充至4 mL，然后依次向其中先加入5%的亚硝酸钠试剂0.4 mL摇匀后静放10 min，再加入10%的硝酸铝试剂0.4 mL并摇匀后静放10 min，再加入4%的氢氧化钠试剂4 mL，之后以50%的乙醇定容至10 mL，震摇后静放15 min。用紫外可见分光光度计在510 nm，以空白溶液校零，检测各浓度的吸光度值A。以不同的芦丁浓度C（μg/mL）为横坐标，各浓度的吸光度值A 为纵坐标绘图，得到线性回归方程。

1.3 材料预处理

将女贞叶、女贞茎和女贞子（青果）、女贞子（紫果）用清水冲洗干净，放置于恒温干燥箱中，70 ℃烘干至恒重，用中药粉碎机粉碎至粉末状态，分别放置于干燥广口玻璃瓶中常温保存。

1.4 超声波提取总黄酮

超声波是一种空化机械波，其产生的空化效应可以加速活性物质的溶出，运用超声辅助提取天然活性物质不仅可以提高得率，还能避免因提取温度过高而对活性物质产生的破坏作用[22-23]。参考周旋等[24]对超声辅助提取女贞子总黄酮工艺研究方法，设计以下操作方法。

准确称取女贞叶粉末2 g 放入锥形瓶中，以料液比1∶50（g∶mL）加入浓度为60%的乙醇100 mL，200 W，超声90 min，4 000 r/min 离心10 min 收集上清，沉淀重复超声一次，合并滤液，取1 mL 总滤液按照1.2 的方法测定吸光度A，带入线性回归方程计算女贞总黄酮的含量，用公式（1）计算得到女贞总黄酮含量（mg/g），重复3 次操作计算平均值，女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）的总黄酮提取方法及计算方式同女贞叶。

1.5 女贞各部位总黄酮粗纯化

将女贞叶、女贞茎和女贞子（青果）、女贞子（紫果）总黄酮提取液分别用旋转蒸发仪进行旋蒸，浓缩成浸膏，用蒸馏水冲洗下来。为除去其中所含的脂溶性杂质及叶绿素等干扰物质，用等量的石油醚溶液对其进行萃取，反复萃取至石油醚层无色，收集水相继续进行旋蒸，浓缩成浸膏，再用无水乙醇溶解，移入离心管中标记为不同部位女贞总黄酮储备液，4 ℃冰箱保存。

1.6 不同部位女贞总黄酮的体外抗氧化性试验

1.6.1 总还原力测定方法

将纯化后的叶、茎、紫果、青果黄酮溶液配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 样品溶液。取0.4 mL黄酮溶液，加入pH 为6.6 的0.2 mol/L 磷酸缓冲溶液和1%的铁氰化钾溶液各1 mL，混匀后50 ℃水浴20 min，冰水浴快速降温，再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，置于离心机，4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液中止反应，静置10 min 后。以蒸馏水调零，于700 nm处测定吸光度，并以相同浓度的抗坏血酸（VC）做阳性对照，重复操作3次取均值。

1.6.2 女贞总黄酮对DPPH·清除作用

将纯化后的叶、茎、紫果、青果黄酮溶液配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL 样品溶液。取样品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.04 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，混匀后放于暗处充分反应30 min，在510 nm 处检测待测溶液吸光度记为A 样品。以无水乙醇代替样品溶液的吸光度值为A 空白，以无水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度值作为A对照 ，以同浓度的抗坏血酸（VC）溶液作为阳性对照。重复3次算平均值，用公式（2）计算得到清除率，公式如下：

1.6.3 女贞总黄酮清除ABTS+·活性测定

取等体积的2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液均匀混合，室温下避光静置16 h 作为储备液避光密封保存。取储备液用蒸馏水稀释，检测734 nm 波长下的吸光度为0.70±0.02 即制得ABTS工作液，溶液现配现用。

将纯化后的叶、茎、紫果、青果黄酮溶液配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL样品溶液。取样品溶液0.2 mL，加入3 mL ABTS 工作液混匀后反应15 min，于734 nm 处测定吸光度A 样品，以蒸馏水代替样品溶液的吸光度值为A空白，以蒸馏水代替ABTS 溶液的吸光度值作为 A 对照，以同浓度的抗坏血酸（VC）溶液作为阳性对照。重复3次算平均值，用公式（2）计算得到清除率。

1.7 数据处理与统计分析

使用Excel统计记录试验数据；芦丁标准曲线、女贞各部位总黄酮含量计算采用Excel 计算分析；用SPSS 5.0 分析计算不同部位总黄酮抗氧化结果的差异显著性及半数清除率；文中图片均采用 GraphPad Prism 5制作。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线见图1，方程是：y=0.012 6x+0.004 5（R2=0.998），当浓度在0.00～60.00 μg/mL 区间时，存在良好的线性关系，可以作为女贞总黄酮含量的计算公式。

图1 芦丁质量浓度标准曲线

2.2 女贞不同部位总黄酮提取率

女贞不同部位总黄酮超声提取测定结果见表1，女贞不同部位总黄酮含量大小为：女贞子（青果）＞女贞子（紫果）＞女贞叶＞女贞茎。女贞树中，女贞子黄酮含量较其他部位高，而不同时期女贞子中黄酮含量存在变化，以青色女贞子总黄酮含量最高。

表1 女贞不同部位总黄酮含量（mg/g）

2.3 女贞不同部位总黄酮抗氧化能力的测定

2.3.1 总还原力的测定

女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）所含总黄酮的总还原力测定结果如图2 所示，在相同浓度下，抗坏血酸（VC）溶液的总还原力明显比女贞总黄酮溶液的总还原力强，女贞4 种样品总黄酮总还原力随样品溶液浓度增加而加强，也具有良好的还原能力。各样品还原能力差异显著性分析结果如图3 所示，样品浓度在0.1～0.3 mg/mL 时，女贞叶与女贞茎还原能力大于女贞青果和紫果，差异显著（P＜0.05）；在0.4 mg/mL 时，女贞青果的还原力增加至与女贞茎还原力相当，女贞叶还原能力较女贞其他3 个部位强（P＜0.05），女贞紫果还原能力小于女贞其他3 个部位（P＜0.05）；在0.5 mg/mL 时，女贞叶（1.747）、女贞茎（1.719）、青果（1.720）还原能力基本持平，紫果（1.535）还原能力较上述3 种小，且差异显著（P＜0.05）。女贞叶和女贞茎与女贞子相比还原能力较好，不同时期的女贞子的还原力有一定的差异。

图2 女贞各样品黄酮总还原力

图3 女贞各样品黄酮总还原力比较

2.3.2 对DPPH·消除率的测定

女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）所含的总黄酮对DPPH·的清除效果如图4 所示，抗坏血酸溶液对DPPH·的消除力高于女贞各样品总黄酮，在0.01～0.06 mg/mL，随着女贞各样品浓度的增加，各样品对DPPH·的消除率增加。在样品浓度为0.06 mg/mL之后，女贞叶、女贞子（青果）、女贞子（紫果）对DPPH·的消除率增长缓慢趋于平稳；在样品浓度为0.01 mg/mL时，三者对DPPH·消除效率达到95%以上；而女贞茎对DPPH·的消除率呈现下降趋势。用SPSS 计算样品对 DPPH·的半数清除率（IC50）并进行差异显著性分析，结果如图5 所示，VC、女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）为0.741、10.539、11.940、8.882、10.150 μg/mL，VC 对DPPH·的消除效率高于女贞各样品，女贞子（青果）对DPPH·的消除效率要优于其他3种样品，女贞4种样品对DPPH·的消除力为：女贞子（青果）＞女贞子（紫果）＞女贞叶＞女贞茎。

图4 女贞各样品黄酮对DPPH·的清除率

图5 女贞各样品黄酮对DPPH·的IC50

2.3.3 对ABTS+·消除率的测定

女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）总黄酮对ABTS+·的消除效果测定结果如图6 所示，VC对ABTS+·的消除力明显高于各部位女贞总黄酮，随着女贞各样品浓度的增加，各样品对ABTS+·的消除率增加，样品浓度在0.20 mg/mL 时，女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）对ABTS+·消除效率分别为92.48%、90.33%、87.25%、81.51%。用SPSS 计算各样品对DPPH·的IC50并进行显著性差异分析，结果如图7所示，VC、女贞叶、女贞茎、女贞子（青果）、女贞子（紫果）对ABTS+·的IC50为26.468、46.571、53.274、76.139、94.669 μg/mL，女贞叶对ABTS+·的消除力较女贞其他3 种成分效果好。女贞4 种样品对ABTS+·的消除力为：女贞叶＞女贞茎＞女贞子（青果）＞女贞子（紫果）。

图6 女贞各样品黄酮对ABTS+·消除率

图7 女贞各样品黄酮对ABTS+·的IC50

3 讨论

从植物中提取黄酮类化合物可以用来制备动物饲料添加剂，利用药用植物的有效成分替代抗生素也是饲料业的研究热点[25]。黄酮类化合物是药用植物体内的次生代谢产物，可以在植物的根、茎、叶、花、果实和种子等各个器官中合成并积累，药用植物的主要药用成分含量随着生长季节和生长年限发生着动态变化；同时，在不同器官与组织中合成或积累的成分质和量也有所不同[26-27]。

在料液比1∶50（g∶mL）、60%的乙醇溶液、超声功率200 W、超声90 min（重复1 次）的条件下提取女贞各部位总黄酮，女贞叶中含量达到35.21 mg/g，女贞茎中达16.38 mg/g，女贞子（青果）中达70.61 mg/g，女贞子（紫果）中达59.92 mg/g。试验结果表明，黄酮类化合物在女贞树不同组织器官中合成和积累的含量有所差异，推测女贞树的果实和叶子是产生黄酮类化合物的主要组织器官；茎作为营养成分运输的组织，黄酮类化合物产生和积累较少。青果时期女贞子中总黄酮含量大于紫果时期女贞子的总黄酮含量，12月份女贞子处于成熟时期，其黄酮化合物含量有所下降。仇小月等[28]研究发现女贞子中总黄酮、总三萜和多糖含量随着月份的递增整体均呈下降趋势，总黄酮和总三萜在9月初达到最大值。郑志慧等[29]研究发现女贞叶和女贞子黄酮含量随采摘时间不同变化幅度明显。研究结果与上述研究相一致，表明女贞果中黄酮类化合物的产生与积累随时间有一定的变化。

3种抗氧化试验数据表明女贞总黄酮有良好的抗氧化能力，其中女贞叶和女贞茎的总还原能力和对ABTS+·的清除能力较女贞子好；女贞子对DPPH·的清除能力优于女贞叶和女贞茎，由此推测女贞不同部位积累的黄酮成分结构存在差异，因此所起到的抗氧化活性不相同。随着各样品浓度增加，女贞子和女贞叶对DPPH·清除率均达到95%以上，且总体而言女贞子（青果）的抗氧化能力高于女贞子（紫果）的能力。上官琨瑶等[30]通过比较月季花不同采收期总黄酮含量与其抗氧化活性，发现月季花总黄酮含量在4 月份最高，7 月份抗氧化活性最强。研究结果也显示女贞子不同时期的总黄酮抗氧化能力有所变化，女贞子（青果）的抗氧化能力高于女贞子（紫果）能力，表明在植物相同部位积累的黄酮种类及结构随生长时间不同也会发生变化。

4 结论

女贞子的总黄酮含量较其他部位高，且青果黄酮得率（70.61 mg/g）也较紫果（59.92 mg/g）高，青果的抗氧化能力也优于紫果，因此在青果期间采摘可以获取更高质量的总黄酮。而女贞叶总黄酮得率虽然较女贞子少，但抗氧化能力良好，且黄酮得率可达到35.21 mg/g。女贞叶资源丰富，也可作为女贞总黄酮获取的材料之一，在制备饲料添加剂方面有一定的研究价值。