肉桂精油复配香芹酚和百里香酚对食用畜禽有害微生物熏蒸的抗菌活性

柴向华，邹冬锌，吴克刚，段雪娟，何东，王贵平，吴保庆，孙明华，刘琳

（1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006）

（2.广东海大集团股份有限公司，广东广州 511400）

近些年来我国食用畜禽产品的消耗量日渐增加，食用畜禽养殖行业快速发展，养殖模式趋向于集约化和规模化。高密度的食用畜禽饲养模式带来高效益的同时，也给食用畜禽动物产品的食品安全带来了新的严峻问题。食用畜禽养殖环境的问题极大地影响了食用畜禽的生产性能与健康状态，同时也会影响其产品如肉、蛋、乳的质量，能否控制好有害食用畜禽的微生物的问题已经成为保证动物类食品质量安全和食用畜禽养殖行业顺利发展的重要因素。有害食用畜禽生理健康的微生物中，白色葡萄球菌、白色念珠菌通过引发呼吸道疾病威胁食用畜禽的健康[1,2]，黑曲霉引起的饲料霉变导致食用了霉变饲料的畜禽患肠道疾病[3]，因此如何控制有害食用畜禽的这三种微生物显得至关重要。

过去，避免动物受到致病微生物危害的主要途径是在动物的饲料中添加抗生素，2015 年9 月我国农业部公告第2292 号禁止了4 类抗生素在食用动物中的使用，而农业农村部第194 号公告宣布2020年起我国的饲料中全面禁止添加抗生素，正式进入饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”的时代，这表明寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品迫在眉睫[4]。植物精油是一类很好的抗生素替代品[5]，牛至油已获农业部批准可作为一种长期添加的药物饲料添加剂，目前国内的牛至油主要依赖进口。肉桂作为一种药食两用的植物，其精油也具有广谱抗菌活性[6]，同时我国拥有丰富的肉桂资源，使用肉桂油替代牛至油具有可行性，但肉桂油的强烈气味限制了其的应用，所以解决肉桂油的气味问题十分关键。牛至油的抗菌主要成分为百里香酚和香芹酚[7]，它们都是被允许用于添加到食品中的天然香料，在具有优秀的综合抗菌能力的同时存在气味较小的优点。有研究显示，多种香料复配并用相比使用单一香料时其抗菌效果更好，原因是复配并用可以扩宽香料的抗菌谱，并且可以在协同作用时减少单体的用量[8]。使用百里香酚和香芹酚复配有利于减小肉桂油强烈的气味，同时提高肉桂油的抑菌能力，扩大其抑菌范围。本文旨在通过将百里香酚或香芹酚与肉桂油复配以达到降低肉桂油使用量，改善肉桂油气味的目的，并利用熏蒸的方式杀死空气中引起畜禽呼吸道疾病的有害微生物，为肉桂精油在动物类食品生产应用和食用畜禽养殖方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料

白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）GIM 1.247、白色念珠菌（Canidiaalbicans）ATCC10231、黑曲霉（Aspergillusniger）ATCC 16404，广东省微生物菌种保藏中心；肉桂精油，百里香酚、香芹酚，广州市香思馨情健康科技有限公司；营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；无水乙醇、丙三醇，天津市大茂化学试剂厂；1,2-丙二醇，天津市致远化学试剂有限公司；食用油，上海嘉里食品工业有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250 生化培养箱，上海锐丰仪器仪表有限公司；YX-280D（242）型手提式压力蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司；SHA-BA 恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司；PEN3 型电子鼻，德国AirSense 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化及菌悬液的制备

细菌及酵母菌悬液的制备：平板划线活化，37 ℃下培养24 h。挑取单个菌落通过麦氏比浊法制成0.5麦氏单位（1.5×108CFU/mL）的菌悬液，再用无菌水稀释为105～106CFU/mL。

霉菌孢子菌悬液的制备；将霉菌接种在平板上活化，28 ℃培养4 d，待平板中长满孢子，向培养皿中加入适量无菌水进行洗脱，将含有孢子的无菌水转移到锥形瓶中，置于振荡器30 min。采用血球板计数法统计孢子数并计算菌悬液浓度，然后用10倍稀释法稀释原始菌悬液至浓度为105～106CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈直径的测定

采用琼脂孔注入法。用直径5 mm 的无菌打孔器在灭菌后冷却凝固的琼脂培养基中心打孔，剔除孔内琼脂，向琼脂孔中添加10 µL 植物精油，盖好培养皿用封口膜封口一圈。同时设置空白对照组（添加无菌水），每组实验设置3 个平行，将密封好的培养皿标记后置于恒温培养箱，细菌37 ℃下培养24 h，真菌28 ℃下培养4 d，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，重复三次取平均直径。

1.3.3 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

采用气相熏蒸法测定最低抑菌浓度[9]。取20 mL高压蒸汽灭菌后的琼脂培养基加入培养皿，冷却凝固后加入100 µL 菌悬液并涂布均匀，待菌液被琼脂吸收后倒放静置。吸取不同体积用丙二醇稀释的精油加入培养皿盖，同时设置对照组添加等量的丙二醇，封口膜封口一圈。不同体积的精油使得培养皿内精油的空间浓度分别为1 000、500、250、125、62.5、31.5 µL/L，另设空白组（涂布无菌水），每组重复3 次于恒温培养箱中倒置培养。细菌在37 ℃条件下培养24 h，真菌28 ℃培养4 d。培养完成后观察生长情况，不长菌平板的精油空间浓度为该精油的最低抑菌浓度。

采用菌块转移法测定最低杀菌浓度。取测定最低抑菌浓度实验中无菌生长的平板，用无菌打孔器在不长菌的平板上取直径为5 mm 的琼脂块转移到新鲜的无菌平板中央（涂布无菌水的平板同理，作空白对照），每组做三个平行，用封口膜密封。细菌在37 ℃条件下培养24 h，真菌28 ℃培养4 d。培养完成后观察实验结果，仍然没有菌生长的平板所对应的精油空间浓度为该精油对应的最低杀菌浓度。

1.3.4 复配肉桂精油抑菌效果的测定

将肉桂精油与香芹酚、百里香酚、百里香酚和香芹酚的混合物（1:1）进行复配，肉桂精油在复配精油中的体积分数分别为0%、20%、40%、50%、60%、80%和100%。采用与1.3.3 相同的实验方法测定肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-香芹酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚三种复合精油对供试菌种的最低抑菌浓度，以分级抑菌浓度指数（Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI）作为联合抗菌试验效果判定依据，判定标准见表1[10]。

表1 FICI指数的判定标准Table 1 Determination criteria of fractional inhibitory concentration index

FICI 计算公式如下：

式中：

D——分级抑菌浓度指数（FICI）；

FN——N的分级抑菌浓度指数；

E联合N——N联合时的最低抑菌浓度，μL/L；

H单用N——N单用时的最低抑菌浓度，μL/L。

1.3.5 溶剂稀释后复配肉桂精油挥发性的测定

使用无水乙醇、丙二醇、甘油、食用油稀释复配肉桂精油，通过德国AirSense 公司PEN3 型电子鼻测定挥发性，研究溶剂稀释对复配肉桂精油挥发性的影响。实验温度25 ℃；复配肉桂精油浓度为1.3.4实验所得最低抑菌浓度；复配肉桂精油在顶空瓶中静置40 min；电子鼻洗气80 s；数据采集100 s；气体流量600 mL/min。

1.3.6 溶剂稀释复配肉桂精油抑菌效果的比较

使用无水乙醇、丙二醇、甘油、食用油稀释复配肉桂精油，以1.3.4 测定的最低抑菌浓度为基准，采用气相熏蒸法测定溶剂稀释复配肉桂精油对供试菌种的最小抑菌浓度，以无菌水、无水乙醇、丙二醇、甘油、食用油作为空白组，不使用溶剂稀释的复配肉桂精油作为对照组，分析比较溶剂稀释复配肉桂精油的抑菌效果。

1.3.7 GC-MS分析肉桂精油组成成分

气相色谱条件：气相色谱仪Agilent 7890B；色谱柱HP-5MS UI（60 m×0.25 mm×0.25 µm）；升温程序为初始温度50 ℃维持3 min，先以2 ℃/min 的速率升温至180 ℃，其后再以20 ℃/min 的速率升温至300 ℃并维持10 min；进样体积为0.2 µL；进样口温度250 ℃；进样方式为精油直接进样；分流比120:1；载气模式为恒流1 mL/min；传输线温度300 ℃。

质谱参数：Agilent 5977B GC/MS；离子化方式为EI，atune；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描范围为29～550 u。

1.3.8 数据分析

抑菌圈、抑菌浓度实验和电子鼻实验数据使用Excel 进行处理，图形绘制使用Origin 2018。GC-MS 实验结果采用Agilent 5977B 进行分析，通过Nist14 质谱库及自建香料谱库进行检索，使用峰面积归一化法计算肉桂精油各组分相对含量，并结合保留时间辅助定性。

2 结果与讨论

2.1 肉桂精油组成成分及其熏蒸抗菌活性分析

2.1.1 肉桂精油组成成分分析

使用气相色谱-质谱联用仪对肉桂精油的挥发性化学成分进行分析，得到肉桂精油挥发性成分总离子流图，如图1。通过在美国国家标准技术研究院Nist14 质谱库和百花香料公司自建香料谱库检索，结合质谱手册并参考相关文献进行核对，共鉴定出29 种化合物，其相对百分含量占色谱总流出峰的95.686%，分析结果见表2。

图1 肉桂精油挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatilel components of cinnamon essential oil

表2 肉桂精油挥发性化学成分分析Table 2 Volatile chemical composition analysis of cinnamon essential oil

由表2 可以看出，在肉桂精油鉴定出的29 种挥发性化学成分中，肉桂醛的含量最高，相对含量为78.191%，其次是2-甲氧基肉桂醛，相对含量为8.703%。从肉桂精油中共鉴定出6 种醛类化合物，相对含量为89.199%；鉴定出11 种烯烃类化合物，相对含量为2.189%；鉴定出2 种酮类化合物，相对含量为1.26%；鉴定出5 种酯类化合物，相对含量为1.231%；鉴定出5 种酚醇类化合物，相对含量为1.179%；其他化合物1 种，相对含量为0.628%。

肉桂精油中的挥发性化学成分中大部分为醛酮类、烯烃类化合物，小部分为酯类、酚醇类化合物，这些化合物主要为小分子化合物，碳原子个数都不超过15。醛类化合物中以肉桂醛为主，肉桂醛具有优秀的抗菌、抗氧化作用[11]。Vasconcelos 等[12]的研究结果显示，肉桂精油抗菌的主要活性成分是反式肉桂醛，反式肉桂醛的活性部位是它的α,β-不饱和羰基。α,β-不饱和羰基是一个亲水基团，易被细菌或者真菌表面的亲水基所吸附从而进入到菌体细胞内，通过破坏细菌或真菌的细胞壁多糖结构导致细菌或真菌死亡，达到抗菌杀菌的效果。

2.1.2 微生物对肉桂精油及百里香酚和香芹酚的敏感性分析

采用抑菌圈分析敏感性。肉桂精油及百里香酚和香芹酚对供试菌种的抑菌圈实验测定结果见表3。

表3 肉桂精油及百里香酚和香芹酚对供试菌种的抑菌圈直径Table 3 Diameter of the inhibition zone of cinnamon essential oil, thymol and carvacrol on the tested strains

供试菌种对抗菌物质敏感性的判定标准如下：抑菌圈直径＞ 20 mm 为最敏感；10～20 mm 为中度敏感，5～10 mm 为低度敏感；无抑制作用（≤5 mm）为不敏感[13]。

根据以上判定标准，从表3 的结果可见，百里香酚和香芹酚两种香料对白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉都表现为最敏感，抑菌圈的直径均＞ 30 mm，尤其对白色念珠菌的抑制更明显，抑菌圈直径可以达到50 mm 以上；肉桂精油对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌圈直径都＞ 30 mm，均表现为最敏感，对于白色葡萄球菌的抑菌圈直径处在10～20 mm 范围内，仅表现为中度敏感。虽然肉桂精油与百里香酚和香芹酚相比，对白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制能力稍弱一些，但对于黑曲霉，肉桂精油的抑菌圈直径超过了百里香酚和香芹酚，这说明肉桂精油对黑曲霉的抑制能力优于百里香酚和香芹酚。

2.1.3 肉桂精油及百里香酚和香芹酚的熏蒸抗菌活性分析

为了了解肉桂精油及百里香酚和香芹酚对于畜禽养殖环境有害微生物的抗菌效果，采用气相熏蒸法测定肉桂精油、百里香酚和香芹酚对于白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度以研究其体外抑菌效果，抑菌实验测定结果如表4 所示。

表4 肉桂精油及百里香酚和香芹酚对供试菌种的MIC和MBCTable 4 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration ofcinnamon essential oil, thymol and carvacrol on the tested strains (μL/L)

表4 中MIC 和MBC 的数值越小，说明其对于供试菌种的抗菌活性越强。由表3 可以看出，肉桂精油、百里香酚和香芹酚对三种供试菌的生长都能产生不同程度的抑制效果。其中，百里香酚的综合抗菌能力最强，对于三种供试菌，百里香酚的MIC都≤ 125 µL/L，MBC 都在250 µL/L 以下，表现出优秀的广谱抗菌性；香芹酚对白色念珠菌和黑曲霉生长的抑制效果没有什么差异，对两种菌的MIC 和MBC 均为125 µL/L，对白色葡萄球菌的抑菌能力则稍弱一点；肉桂精油对于白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果与百里香酚和香芹酚相比存在一定的差距，不过对黑曲霉则表现出很强的抑菌能力，MIC 和MBC 都低于百里香酚和香芹酚，这也验证了敏感性分析实验的结果。汪美君[14]的研究结果也表明，相比细菌，肉桂精油对真菌抑制能力更强，这是由于肉桂精油对不同菌种作用机制的差异引起的。

肉桂精油的主要抗菌成分是肉桂醛，当作用于细菌时，肉桂醛破坏了细菌的细胞形态，影响了菌体的细胞膜通透性，使得细胞膜变形或产生褶皱而破裂，由于细胞膜的完整性遭到了破坏，导致细菌胞体内的营养物质泄漏，因此细菌的生长受到了影响，同时，菌体细胞膜的电位值因胞内电解质的流失而降低，新陈代谢产生紊乱，最终导致细菌死亡[15]。而对于真菌和霉菌，肉桂醛是通过破坏其细胞壁进入到菌体细胞内，改变菌体胞内大分子的空间结构，减弱菌体利用碳源的能力从而影响其新陈代谢，最终使得菌体死亡[16]。

2.2 百里香酚和香芹酚对肉桂精油熏蒸抗菌作用的影响

按肉桂精油在复配精油中的体积分数为0、20%、40%、50%、60%、80%、100%将肉桂精油与百里香酚、香芹酚、百里香酚和香芹酚的混合物分别复配，测定MIC 并计算FICI，分析百里香酚和香芹酚对肉桂精油熏蒸抗菌的协同效应，结果如表5 所示。

表5 复配肉桂精油对供试菌种的FICITable 5 Fractional inhibitory concentration indexof the compounded cinnamon essential oilon the tested strains

总体上看，三种复配精油对黑曲霉抗菌效果的提升明显优于白色葡萄球菌和白色念珠菌，尤其以肉桂精油-百里香酚组合最为显著，不同组合中肉桂精油所占比例也有差异。从表5 中可以看出，三种复配精油组合肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-香芹酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚对黑曲霉都表现出相加作用，FICI 分别为0.64、0.72 和0.7，对于白色念珠菌则全都表现为无关作用，其中复配组合肉桂精油-香芹酚的FICI 数值是最小的。虽然肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚对于黑曲霉的FICI 数值略小于肉桂精油-香芹酚，但是复配组合肉桂精油-香芹酚相比另外两种组合，对白色葡萄球菌也表现出了相加作用，FICI 为0.96，这是因为香芹酚对白色葡萄球菌的抑菌机制与肉桂精油不同，两者对白色葡萄球菌的抑制效果相互叠加造成的[17]。

尽管香芹酚与肉桂精油没有协同增效作用，但是可以通过香芹酚的替代来减少肉桂精油的使用量，这不仅可以有效减小肉桂精油的气味[18]，并且可以增强肉桂精油对白色葡萄球菌的抑制能力。综合来看，使用香芹酚与肉桂精油进行复配为较优选择。

2.3 溶剂稀释对复配肉桂精油挥发性及熏蒸抗菌活性影响

2.3.1 电子鼻分析

五种复配肉桂精油的电子鼻指纹图谱如图2 所示，PEN3 型电子鼻各不同传感器所对应代表的化合物种类见表6[19]。

图2 五种复配肉桂精油电子鼻传感器响应值指纹图谱Fig.2 Response value fingerprint of electronic nosesensor of five compounded cinnamon essential oil

表6 不同传感器序号所代表的化合物种类Table 6 Compounds represented by different sensor equences

结合表6 对图2 进行分析，五种复配肉桂精油对S1、S3、S4、S5、S10 传感器的响应值均比较低。S1 传感器主要响应苯类芳香成分，S3 传感器主要对氨类灵敏，S4 传感器主要对氢化物有选择性，S5传感器主要对短链烷烃、芳香类成分灵敏，而S10传感器主要响应长链烷烃，对脂肪族灵敏。由图2b和图2c 分析得出，五种复配肉桂精油中苯类、氨类、短链烷烃和长链脂肪烃类芳香成分的含量非常少，这与2.1.1 中肉桂精油的总挥发性化学成分分析的结果相符。从图2a 看到，使用无水乙醇稀释的复配肉桂精油对S2、S6、S8 传感器产生了相当高的响应值，响应值均＞ 200，这是因为无水乙醇具有极强的挥发性，其大量挥发后本身具有的羟基和甲基被对氮氧化合物、甲基类化合物和醇类化合物灵敏的传感器所响应。从S9 传感器的响应值可以看出，使用无水乙醇或丙二醇稀释可以使复配肉桂精油的芳香成分更好地挥发出来，而使用甘油或食用油稀释复配肉桂精油，由于复配肉桂精油在甘油中的溶解度低，在食用油中的挥发性差，导致这两种复配肉桂精油对S9 传感器的灵敏度低于未使用溶剂稀释的纯精油，使得电子鼻难以进行区分。此外，未使用溶剂稀释的纯复配精油除了使用无水乙醇稀释的复配肉桂精油外，其S7 传感器的响应值均大于其他三种溶剂稀释的复配肉桂精油。S7 传感器对萜烯类化合物敏感[20]，萜烯类化合物易溶于无水乙醇并挥发，但在丙二醇、甘油、食用油中溶解挥发量少。总体上看，使用无水乙醇或丙二醇稀释可以有效地促进复配肉桂精油中芳香成分的挥发，但无水乙醇本身的基团也会对电子鼻的分析结果产生影响，通过电子鼻可以对复配肉桂精油进行分析，其对挥发性化学成分的分析结果具有一定的准确性。

2.3.2 溶剂稀释后复配肉桂精油的熏蒸抗菌活性分析

根据敏感性分析和最低抑菌浓度的实验结果，选择香芹酚复配肉桂精油，通过测定使用不同溶剂稀释的复配精油对白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的最低抑菌浓度，研究不同的溶剂稀释对于复配肉桂精油抗菌活性的影响。

使用不同溶剂稀释后，复配肉桂精油的抑菌实验结果如表7 所示。从表7 中可以看出，使用无水乙醇作为溶剂稀释可以增强复配精油的抗菌活性，不使用溶剂稀释，使用甘油或者食用油稀释无法达到使用1,2-丙二醇作为溶剂稀释的复配精油的抗菌效果。崔绮嫦等[21]的实验结果显示，在相同浓度的情况下，复配精油对供试菌种抑制效果的差异是由于复配精油在不同溶剂中的溶解度与挥发性的不同引起的。复配肉桂精油可以很好地在无水乙醇、1,2-丙二醇和食用油中溶解，但在甘油中表现为部分溶解。在挥发性方面，不使用溶剂稀释的纯复配精油和使用食用油稀释的复配精油挥发性十分有限，因此精油的有效抗菌成分无法顺利作用于菌体，导致实际抑菌效果远不如使用无水乙醇或者1,2-丙二醇稀释的复配精油。此外，使用甘油作为溶剂稀释与使用食用油相比，实验结果十分相近，虽然复配精油在食用油中的溶解度高于甘油，但在甘油中的复配精油挥发性大于在食用油中的，两方面的因素综合起来最终使得这两种复配精油产生的抑菌效果没有太大区别。

表7 不同溶剂稀释的复配肉桂精油对供试菌的最低抑菌浓度比较Table 7 Comparison of the minimum inhibitory concentration of compound cinnamon essential oil diluted with different solvents on the tested strains (μL/L)

3 结论

肉桂精油、香芹酚和百里酚对三种有害食用畜禽健康的微生物白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉都具有一定程度的抑杀作用，百里香酚和香芹酚对白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制能力优于肉桂精油，肉桂精油对黑曲霉的抑制能力则优于百里香酚和香芹酚。使用香芹酚与肉桂精油进行复配可以明显加强肉桂精油的抑菌效果，肉桂精油-香芹酚复配组合对白色葡萄球菌和黑曲霉都表现出了相加作用（FICI≤1），对白色葡萄球菌的FICI 为0.96，对黑曲霉的FICI 为0.72，与白色葡萄球菌相比，肉桂精油-香芹酚复配组合对黑曲霉抑菌能力的提升更高。GC-MS 分析结果显示，肉桂精油具有抗菌作用的主要挥发性化学成分为肉桂醛，占总挥发性化学成分相对含量的78.19%。采用电子鼻分析溶剂稀释对复配肉桂精油挥发性及熏蒸抗菌活性的影响，无水乙醇或丙二醇稀释可以有效地促进复配肉桂精油中芳香成分的挥发，相同空间浓度下，这两种复配肉桂精油的抑菌效果优于未使用溶剂稀释的纯复配肉桂精油和使用甘油或食用油稀释的复配精油，但无水乙醇本身的基团会造成电子鼻S2、S6、S8 传感器响应值过高，会对电子鼻的分析结果产生影响。综合来看，选用香芹酚与肉桂精油进行复配，使用丙二醇作为溶剂对于肉桂精油抑菌能力的提升是最佳和影响最小的，以丙二醇为溶剂稀释的肉桂-香芹酚复配组合精油是对食用畜禽有害微生物发挥稳定高效抗菌作用的最优选择。