外源 GABA 联合超声处理发芽绿豆淀粉的结构特性及血糖指标变化

路乐乐，刘莹，徐海军，李晓强，隋春光，李晓红，王立东,4*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

（2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010000）

（3.黑龙江农业经济职业学院食品药品工程系，黑龙江牡丹江 157041）

（4.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江省普通高等学校谷物副产物综合利用重点实验室，黑龙江大庆 163319）

绿豆又名青小豆、植豆，是一类传统粗粮作物，在我国已有两千多年栽培历史[1]。绿豆用途十分广泛，具有清热消暑[2]、降脂解毒[3]作用。绿豆中含有25%～28%蛋白质、50%～60%淀粉，以及多酚、黄酮、维生素等众多营养成分，因此绿豆具有极高营养价值[4]。随着人们饮食逐渐精细化，亚健康人群比例逐年上升，健康饮食成为人们新的诉求。传统绿豆制品淀粉含量较高，易造成餐后血糖水平和胰岛素浓度大幅波动。为寻求GI 值降低的绿豆淀粉制品，选择合适的加工处理工艺就显得尤为重要。

发芽处理是一种操作简单，成本低廉的加工方式。有研究表明，适当发芽处理可提高玉米中抗性淀粉含量[5]，而抗性淀粉含量较高的食品可以显著抑制餐后血糖升高，为低GI 食品的开发提供理论依据。GABA 是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于植物和动物体中，它在植物生长中具有激活信号、调节蛋白质降解、促进植物激素合成等作用[6]。超声处理可以提高种子发芽率，促进活性化合物的积累[7]。研究发现，低强度超声的空化效应可以提高细胞壁和细胞膜的穿透性，增强种子水合作用和酶活性，加快细胞内外物质交换及代谢速率[8]。超声预处理的空化作用在种子细胞壁上产生的微小孔隙可以促进GABA 从外部向种子内部的转移，进而参与绿豆种子的代谢，提高淀粉酶和多酚合成酶的活性。

因为外源GABA 浸泡处理可以激活水解酶活性，超声处理有利于提高细胞壁和细胞膜的通透性，所以本实验旨在研究外源GABA 联合超声处理对发芽0～96 h 绿豆淀粉结构特性和血糖指标的影响，以期获得GI 值低、感官性能良好的绿豆淀粉产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆种子购买于北大荒粮食集团有限公司（中国大庆）；次氯酸钠、GABA、氢氧化钠、乙酸钠、无水乙醇、无水葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸购买于上海麦克林生化科技股份有限公司（中国上海）；猪胰腺α-淀粉酶、糖化酶购买于上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。

1.2 仪器与设备

KH-500GDV 超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；HH-4 型电热恒温水浴锅，江苏省金坛市宏华仪器厂；DHG-101-0A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海尚仪生物技术有限公司；CHA-2A 气浴震荡器，常州申光仪器有限公司；ZXMP-R1230 恒温恒湿培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；S-3400N 扫描电子显微镜，日本HITACHI 公司；BrukerD8 X-射线衍射仪，德国ADVANCE 公司；Nicolet 6700 傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 绿豆发芽处理

选取大小均匀、无损伤的完整绿豆。将绿豆种子在质量分数0.5%次氯酸钠溶液中浸泡15 min，用蒸馏水冲洗后沥干水分。将处理过的绿豆种子放入250 mL 烧杯中，按豆液比1:3 加入10 mmol/L GABA溶液，样品置于超声清洗器中处理40 min 后再30 ℃恒温处理8 h。将浸泡好的绿豆放入发芽盘中，发芽盘底部放置10 mmol/L 的GABA 溶液500 mL，然后将样品置于30 ℃湿度75%的培养箱中，孵育12、24、48、72、96 h，每12 h 换一次GABA 培养液。取样后用蒸馏水冲洗去除黏液，45 ℃热风烘干保持恒重。将样品压碎并保存在4 ℃的冰箱中。未处理的样品标记为M，而发芽0、12、24、48、72和96 h 的样品分别标记为M0、M12、M24、M48、M72 和M96。

1.3.2 淀粉提取

精确称取100.0 g 绿豆芽粉，过用80 目筛，将样品置于2 000 mL 烧杯中，加入1 500 mL 质量分数0.4% NaOH 溶液并充分混合。然后将样品置于35℃气浴振荡器中，170 r/min 摇2 h，后静置1 h，调节pH 值为7.0，去除上清液，沉淀物用蒸馏水反复洗涤、离心，并用80 目尼龙纱布过滤，得到纯净淀粉。淀粉在40 ℃下干燥24 h，研磨后过90 目筛得到发芽绿豆淀粉[9]。

1.3.3 淀粉含量

淀粉含量采用GB 5009.9-2016[10]酸水解法测定。

1.3.4 直链淀粉和支链淀粉含量采用高菲等[11]的双波长法测定淀粉样品中的直链淀粉和支链淀粉含量。

1.3.5 扫描电镜分析

将少量绿豆淀粉样品用导电双面胶固定到金属样品台上，在真空条件下进行喷金处理，置于扫描电子显微镜下观察，加速电压为5 kV，放大3 000倍观察样品形状和表面特征[12]。

1.3.6 X-射线衍射分析

采用X 射线衍射仪（XRD），通过步进扫描法检测淀粉，检测条件：特征射线Cu 靶，管压为40 kV，电流为40 mA，测量角度2θ区间为4～60°，步长为0.02°，扫描速度为2°/min。使用MDI Jade 软件分析计算淀粉结晶度，结果取3 次拟合平均值[13]。

1.3.7 傅里叶红外光谱分析

称取被测样品3.0 mg，与300.0 mg KBr 粉末研磨至混匀，经压片处理后通过红外光谱分析仪进行全波段扫描测试，波长范围为400～4 000 cm-1，分辨频率为4 cm-1，扫描次数为64 次[14]。

1.3.8 凝沉性测定

制备不同发芽时间质量分数1%的淀粉糊50 mL，取7 支10 mL 塑料离心管，向每支离心管中分别移取10 mL 糊液，在25 ℃下静置24 h 后，再以转速4 000 r/min 离心5 min，记录离心管中沉降物占比[15]。

1.3.9 估计血糖生成指数的测定

淀粉用猪胰腺α-淀粉酶和糖化酶进行模拟消化。将600 mg（精确到0.001 g）淀粉准确称量到30 mL 醋酸钠缓冲液（pH 值 5.2）中。将样品混合并在95 ℃下糊化15 min，糊化后样品在37 ℃恒温平衡1 h。加入5 mL 猪胰腺α-淀粉酶（100 U/mL）和糖化酶（40 U/mL）混合物。在37 ℃气浴中摇动样品（170 r/min），并在10、20、40、60、90、120 和180 min 时取样。加入无水乙醇终止消化，以4 000 r/min 离心5 min[16]。

准确称取100.0 mg 葡萄糖，溶于少量蒸馏水中，并定容于100 mL 容量瓶中，分别移取0.0、 0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 mL 葡萄糖标准溶液于25 mL 容量瓶中，加入蒸馏水定容至2 mL，然后加入1.5 mL DNS 试剂并摇匀，在沸水中加热5 min，迅速冷却定容至25 mL，混匀后于540 nm 波长处测定吸光度[16]。标准曲线为：y=12.036x+0.022 4（R2=0.994 8）。

以淀粉水解率（HRS）为纵坐标，以时间为横坐标绘制水解曲线。通过计算0～180 min 淀粉（AUCsample）水解曲线下面积和参考食物（白面包，AUCreference）来确定样品淀粉水解指数（HI）。样品估计血糖指数（eGI）按照以下公式计算[16]。

式中：

A——抗性淀粉含量（RS），%；

G120——消化120 min 时释放的葡萄糖含量，mg；

B——消化20 min 时释放的葡萄糖含量，mg；

C——淀粉的质量，mg；

D——淀粉的水解速率（HRS），%；

m1——在采样点消化的葡萄糖当量，mg；

E——样品淀粉水解指数（HI）；

Ssample——0～180 min 淀粉（AUCsample）水解曲线下面积；

Sreference——参考食物（白面包，AUCreference）水解曲线下面积；

I——血糖指数（eGI）。

1.3.10 数据分析

每组实验均做三次平行试验，采用SPSS 26 进行统计分析，Origin 2021 绘图，数据结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 淀粉含量及组成

GABA 联合超声处理12～96 h 绿豆的淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉和抗性淀粉含量如图1 所示。淀粉在绿豆种子中的占比较高，采用发芽处理降低淀粉含量，改善淀粉消化吸收速率，这对研究低GI绿豆食品有着重要的意义。Oliveira 等[17]研究表明，发芽可改善稻米消化率，提高生物活性。Chinma等[18]研究表明，种子萌发在分子水平上显著改变了淀粉的结构，影响了淀粉的功能。根据图1 可知，发芽绿豆中淀粉含量显著降低，绿豆中淀粉含量最初为52.13%，随着发芽时间的延长，在发芽24 h降低至43.54%，在96 h 时降至最低为21.18%。这种减少是由于超声处理后种皮的渗透性增强所致，因为超声处理可以改变细胞壁结构，提高内源酶活性，内源酶通过细胞壁释放，从而提高淀粉酶水解效率[19]。

图1 发芽绿豆中淀粉的含量和组成Fig.1 The content and composition of starch in mung bean sprouts

研究表明，直链淀粉与支链淀粉比值的变化是延缓淀粉消化的有效方法[17]。绿豆发芽过程显著提高了直链淀粉的占比，在发芽12 h 达到峰值。这可能是水解酶优先裂解支链淀粉形成直链淀粉的结果[20]，而超声处理又增强了淀粉酶活性，加速了支链淀粉的水解，导致直链淀粉和抗性淀粉的比例增加。发芽后，抗性淀粉含量在萌发过程中呈上升趋势，这可能是由于淀粉水解酶将淀粉分解成糊精和葡萄糖[18]的原因。而抗性淀粉不易被淀粉酶水解，导致了12 h 时抗性淀粉含量最高。随着发芽时间的增加，芽的生长需要淀粉水解提供能量，部分抗性淀粉开始水解，导致种子萌发后期抗性淀粉含量降低。

2.2 扫描电镜分析

天然绿豆淀粉和不同萌发时间绿豆淀粉的扫描电镜如图2 所示。在3 000 倍显微镜下观察淀粉颗粒主要呈椭圆形，形貌无显著性差异，部分颗粒不规则，呈肾形或心形。淀粉颗粒没有出现裂缝或孔洞，因此，延长发芽时间并没有导致绿豆淀粉颗粒的大量断裂。发芽后，部分淀粉颗粒变粗，有微蚀坑，但大部分完好无损，这可能是由于超声空化效应和淀粉酶、脱支酶活化水解淀粉造成的表面损伤[21]。淀粉颗粒表面的破坏归因于发芽过程中淀粉的使用量增加[18]，水解酶在萌发过程中被激活，部分淀粉水解，使淀粉颗粒表面产生凹陷，这与王倩[5]的研究结果一致。籽粒中直链淀粉与支链淀粉的比例可能是种子萌发过程中淀粉颗粒形态变化的主要原因，而直链淀粉水平较低的淀粉更容易受到酶的攻击，并产生更多的凹坑[22]。

图2 不同发芽时间绿豆淀粉的扫描电镜照片(×3 000)Fig.2 SEM pictures of mung bean starch at different germination times (×3 000)

2.3 X-射线衍射分析

天然绿豆淀粉和不同萌发时间绿豆淀粉的XRD谱图如图3 所示。不同发芽时间的样品分别在15°、17°、18°、20°和23°处出现明显较强衍射峰，为典型的A 型结构。不同发芽时间的绿豆淀粉其特征衍射峰无明显变化，这表明发芽时间的长短对淀粉的结晶区没有造成明显的影响，即发芽处理并未改变绿豆淀粉的结晶类型，这与Liu 等[23]的研究结果一致。虽然发芽绿豆淀粉的特征衍射峰无明显变化，但其特征衍射峰的强度却有所减弱，这意味着发芽后淀粉结晶性下降。

图3 不同发芽时间绿豆淀粉的XRD 谱图Fig.3 XRD spectrum of mung bean starch with different germination time

天然绿豆淀粉和不同萌发时间绿豆淀粉的相对结晶度如表1 所示。未处理绿豆淀粉的相对结晶度为39.64%，经过发芽处理后，绿豆淀粉的相对结晶度明显降低。绿豆淀粉经过GABA 浸泡联合超声处理后相较于未处理绿豆淀粉结晶度下降，这是由于超声处理的空化作用可以使种皮的渗透性增强，同时GABA 浸泡处理激活内源酶的活性，导致结晶度下降[19]。在萌发过程中，淀粉被水解提供能量，而淀粉的非结晶区先被水解，然后结晶区域再被水解[24]。绿豆淀粉萌发48 h 内，绿豆淀粉的非结晶区首先被水解，使相对结晶度有所增加，而萌发时间超过48 h 之后，绿豆淀粉的结晶区也被逐渐水解，使结晶结构被破坏，分子链间的相互作用减弱，导致淀粉颗粒的结晶度降低，这与Frost 等[25]的研究结果一致。

表1 不同发芽时间绿豆淀粉的相对结晶度Table 1 Relative crystallinity of mung bean starch with different germination time

2.4 傅里叶红外光谱分析

天然绿豆淀粉和不同萌发时间绿豆淀粉的FT-IR 曲线如图4 所示。绿豆淀粉在1 423、1 157、1 039 和931 cm-1处吸收带的吸收强度没有变化，不同发芽时间绿豆淀粉未出现红移。1 423、1 039和931 cm-1的吸收峰表明存在C-O-H 拉伸振动，1 157 cm-1处CH2相关峰表明C-O 拉伸振动[26]。峰强度变化可能归因于发芽期间结构部分损坏，由于淀粉结构不稳定，使键振动所需能量低。不同发芽时间绿豆淀粉的特征吸收峰无明显变化，所以发芽处理并没有使绿豆淀粉产生新的基团，这与刘裕[27]的研究结果一致。

图4 不同发芽时间绿豆淀粉的FT-IR 曲线Fig.4 FT-IR curve of mung bean starch with different germination time

1 045 和1 022 cm-1处吸收峰表明淀粉颗粒结晶区和非结晶区的数量，1 045 cm-1/1 022 cm-1处峰强度比如表2。随着发芽时间的延长，绿豆淀粉在1 045 cm-1/ 1 022 cm-1处峰强度比呈先上升再下降的趋势。1 045 cm-1/1 022 cm-1峰强度比的下降可能是由于发芽的绿豆淀粉结晶区的双螺旋结构被破坏[28]。随着发芽时间的增加，淀粉的有序度变化不大，但在发芽12 h 时和48 h 之后，有序度有下降的趋势，这表明发芽处理会使淀粉的有序结晶结构遭到破坏，淀粉晶体结构由有序向无序转变[9]。此外，1 045 cm-1/1 022 cm-1峰强度比与XRD 测量的结晶度变化略有差异，这可能是由于FT-IR 透过力低，只能穿透淀粉颗粒表面，而不是整个淀粉颗粒，而X 射线衍射可以穿透整个淀粉颗粒。

表2 不同发芽时间绿豆淀粉1 045 cm-1/1 022 cm-1有序度Table 2 1 045 cm-1/1 022 cm-1 orderliness of mung bean starch at different germination times

2.5 凝沉性分析

淀粉的凝沉性和老化特性有着密不可分的关系，直接反映了淀粉的老化程度。不同发芽时间绿豆淀粉的沉降物占比如图5 所示。随着沉降时间的加长，沉降物的占比在逐渐下降，同时随着发芽时间的延长，淀粉沉降物占比有所增加，这与熊柳等[29]的研究结果一致。支链淀粉分子具有支叉结构，凝沉性较差，而直链淀粉分子因具有线性结构，其凝沉性较强。随着发芽时间的延长，支链淀粉分子被不断水解，造成支链淀粉分子所占比例下降，因此具有更强的凝沉性。朱彩玲等[15]研究表明，凝沉性增强意味着发芽绿豆淀粉抗老化能力减弱，所以发芽后的绿豆淀粉会更容易老化回生。老化回生的淀粉抗消化能力较强，这为低GI 的绿豆淀粉制品生产提供依据。

图5 不同发芽时间绿豆淀粉的沉降物占比Fig.5 Proportion of sedimentation of mung bean starch at different germination time

2.6 估计血糖生成指数

绿豆淀粉在不同萌发时间的估计血糖生成指数如表3 所示。发芽绿豆淀粉的估计血糖生成指数呈先下降后上升的趋势，这可能是由于抗性淀粉在12 h 含量达到最高，随着发芽时间的延长，抗性淀粉水解使估计血糖生成指数回升，这与何李晔紫[30]的研究结果一致。淀粉消化率受淀粉颗粒大小、淀粉与脂质或淀粉与蛋白质相互作用、淀粉链长度、直链与支链淀粉比、淀粉与多酚相互作用等因素的影响，同时它还受到许多外界因素的影响，如储存时间、淀粉糊化、淀粉再生和消化酶活性[31]。发芽刺激了内源性α-淀粉酶活性，随着发芽时间的增加，非结晶区淀粉分子发生分解，抗性淀粉含量逐渐增加。发芽处理后消化率降低，这可能是由于发芽过程中淀粉分子结构的变化和冷却过程中淀粉老化所致[32]。绿豆在萌发过程中富集了多种多酚类化合物，这些多酚类化合物可能与直链淀粉和支链淀粉相互作用形成短程有序结构[33,34]。淀粉的化学结构、酚类化合物的浓度和类型以及食物的加工方式都会影响这些相互作用。酚类化合物在糊化过程中与淀粉形成V 型淀粉包体化合物，导致淀粉消化率降低[35]。

表3 不同发芽时间绿豆淀粉的估计血糖生成指数Table 3 Estimated glycemic index of mung bean starch at different germination time

3 结论

本实验通过外源GABA 联合超声处理绿豆种子萌发。通过对绿豆发芽过程的观察与检测，分析发芽对淀粉结构特性和血糖指标变化的影响。GABA联合超声处理能增强淀粉水解酶活性，由于水解酶的作用使淀粉降解，因此绿豆发芽后总淀粉含量稳步降至21.18%；发芽增加了绿豆直链淀粉和抗性淀粉的含量，抗性淀粉在12 h 达到了70.65%，随着萌发时间的延长，抗性淀粉不断被降解，绿豆淀粉的估计血糖生成指数也在缓慢的回升。根据扫描电镜分析可知，发芽后绿豆淀粉颗粒无显著变化。根据X-射线衍射分析和傅里叶红外光谱分析可知，发芽绿豆淀粉为典型的A 型结构，发芽后绿豆淀粉颗粒的结晶类型并没有改变，相对结晶度由39.64%下降到96 h 的12.72%，但随着发芽时间的延长，在淀粉水解酶的作用下，绿豆淀粉的晶体结构受到了一定的破坏。发芽处理绿豆淀粉没有新的特征吸收峰出现，因此没有产生新的基团，但淀粉晶体结构的有序性降低，这使淀粉晶体结构由有序向无序转变。随着发芽绿豆淀粉的凝沉性增强，其抗消化能力也有所增加，在发芽12 h 时绿豆淀粉的估计血糖生成指数也降到了22.52，起到了减缓血糖升高的作用。发芽绿豆淀粉在生产需要低粘度材料的食品（蛋糕、饼干）方面具有潜在的应用价值，本研究有助于从发芽绿豆中分离出合适的淀粉应用于食品工业，为其在功能食品中的应用提供了理论依据。