供者来源游离DNA在肝移植领域相关研究与应用进展

梁 田,杨洪吉,狄文佳

(1.电子科技大学医学院,四川 成都 611731;2.四川省医学科学院·四川省人民医院器官移植中心,四川 成都 610072)

在过去的几十年里,肝移植术后一年后的长期生存率并没有改善[1,2]。移植排斥反应(transplant rejection)是指:受者进行同种异体组织或器官移植术后,外源性的组织或器官等移植物被受者免疫系统识别,受者发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应。排斥反应的发生机制主要包括细胞免疫和体液免疫这两部分。临床最常见的急性排斥反应主要由细胞免疫介导,而超急性排斥反应和慢性排斥反应主要由体液免疫介导。患者需长期进行免疫抑制治疗,来保证移植器官功能。肝移植术后患者(liver transplantation patients,LT)死亡数约四分之一来源于长期使用免疫抑制剂导致移植物出现感染,肿瘤等并发症。移植物出现术后功能障碍导致移植患者死亡的数量约占11%～12%[1]。个性化免疫抑制(individual immunosuppression,IS)有望对LT后的长期生存产生积极影响,并能更好地平衡必要的异体反应性抑制和慢性IS的不良影响。在前瞻性研究IS最小剂量的实验中,强调了移植物穿刺活检的重要性[3～5],穿刺活检能对IS指导作出有效价值,虽然穿刺活检具有较高的准确性,但穿刺活检价格昂贵,且不是肝移植患者常规随访项目[6],因此,需要一种更为简单,有效的方法代替移植肝穿刺活检。

1 供体来源细胞游离DNA

1.1 供体来源细胞游离DNA概述根据目前研究,最有前途的标记物之一便是供体来源细胞游离DNA(donor-derivedcell-free DNA,ddcfDNA)[7]。ddcfDNA是一种来源于移植器官细胞的游离胞外DNA。可以在肝移植术后患者的血液与尿液中检测出。而且近期相关研究表明,血液中ddcfDNA水平的绝对和相对增加与移植物损伤的程度有关,例如,在缺血/再灌注损伤或排斥发作期间。患者血液中ddcfDNA绝对值上升。因此,在诊断急性排斥反应时,ddcfDNA似乎比常规肝酶相关指标更精确[8,9]。然而,以往的研究仅限于肝移植术后1年内移植物损伤的评估[7]。近年来,关于ddcfDNA预测移植肝损失及检测移植肝功能的实验越来越多,受目前试验条件受限,数据及结论也大不相同。

1.2 供体来源细胞游离DNA检测移植物损伤的可行性随着以PCR二代测序为基础的高敏感性、高通量检测技术的应用,通过多种方法证实可在移植受者血,尿样本中检测到ddcfDNA及其所占总细胞游离DNA的比例[11,12]。近年来,越来越多的研究表明,ddcfDNA在肾移植术后移植肾功能检测中具有巨大前景以及应用价值。浙江大学Jiashen团队[12]的一项关于尿ddcfDNA与BK肾病的研究,此实验收录了147例患者的尿液血液标本,此实验证实了在急性移植肾损伤时,患者ddcfDNA水平明显更高,另外也指出尿ddcfDNA水平可以区分1型T细胞介导的排斥反应与BK多瘤病毒相关肾病,他们认为ddcfDNA可以作为一种移植物损伤标志,特别对于BK肾病领域。研究指出:在器官移植术后患者中,尿液ddcfDNA含量与血液ddcfDNA含量具有相关性,该研究指出,移植物受损的患者中,尿液中ddcfDNA含量成实质性增高,且血液中含量同时成相关性增高。表明利用尿液检测相关DNA含量评估移植物是否受损同样具有可行性。尿液相对于血液来说,为更容易采集的标本且更易于保存,对于患者来说更容易接受且普及。因此,大家开始广泛研究ddcfDNA对于其他移植如肝移植、心脏移植、肺移植等是否具有同样价值。

2 供体来源细胞游离DNA在肝移植领域研究进展

在肝移植相关ddcfDNA的研究试验中,Beck等[13]研究发现两例移植术后发生急性排斥反应患者的血液中ddcfDNA含量增高超过正常值的55%～60%。此外,移植物相关并发症如感染、血肿时也会影响ddcfDNA含量水平[14]。Macher等[15]研究发现当肝移植出现急性排斥反应、肝动脉或静脉血栓或多器官功能衰竭导致的移植物损伤,血液中ddcfDNA及总细胞游离DNA含量均会有不同程度增高。而在非移植物损伤性并发症中如胆源性腹膜炎或创口感染,ddcfDNA含量无明显异常升高或降低。Baumann等[16]对其中心61亚临床移植物损伤患者的研究发现,无组织性发生排斥反应的患者(包括亚临床T细胞介导的排斥反应以及临床显性T细胞介介导的排异反应),其患者的血液ddcfDNA绝对值逐步增加。以上研究均显示ddcfDNA有望成为一种监测各类器官移植物损伤的通用生物标记物。此外,有部分研究发现在肝移植发生早期明显的急性排斥反应的前一周,ddcfDNA已开始增高[14]。Levitsky等[17]进行了一项试验,旨在评估ddcfDNA在肝移植受者移植物损伤诊断和作为移植物功能障碍不同原因之前的预测生物标志物的效用。实验分析其移植中心LT队列的血浆中ddcfDNA。将经活检证实的急性排斥反应患者(AR,n=57)、功能正常患者(TX,n=94)和急性功能障碍且无排斥反应患者(ADNR,n=68)按一定要求分组对比,其ddcfDNA检测损伤的准确性高达87%,从LT连续采集的血液样本显示,在移植物功能障碍发生前(包括急性排斥反应患者与急性功能障碍但未发生排斥反应者),ddcfDNA就以升高,但在功能正常患者中没有升高。因此他们指出,在肝功能正常的情况下,ddcfDNA的连续升高可能可以识别移植物临床前损伤,并且在移植物发生排斥反应中最明显。该生物标志物可帮助发现移植物损伤和排斥反应的早期迹象,为肝移植受者的管理策略提供相关参考价值。根据上述实验结果,可知ddcfDNA在亚临床排斥反应早期诊断中具有一定的应用价值。但Baumann等[16]同时指出:ddcfDNA片段在无创预测相关亚临床移植物损伤方面的准确性虽然高达87%,但其敏感性和特异性相当有限,在一定的ddcfDNA片段的截断值下,其预测灵敏度和特异性分别为73%和52%。根据此前瞻性监测活检计划中移植物损伤的患病率计算,ddcfDNA分数高于预设值的阳性预测值为76%,而阴性预测值为47%,因此不能实用ddcfDNA预测亚临床移植物发生损伤的可能。而ddcfDNA仅仅只能作为移植物是否发生损伤的检测指标。以上部分观点前后矛盾,可能的原因有:①样本量少,出现小样本得出大结论的可能。②受地区、人种、年龄等多方面影响可能造成选择偏倚。③目前各个中心检测方法不同,造成数据差异。

3 供体来源细胞游离DNA与个体化免疫抑制治疗

3.1 个体化免疫抑制治疗患者进行肝移植之后,由于人免疫系统对外源性肝脏具有攻击抵制作用,患者术后需要进行免疫抑制治疗来减少免疫系统对移植肝脏的攻击。根据之前提供的数据显示,移植受者约四分之一死亡来源于长期使用免疫抑制剂所产生的不良反应导致移植器官衰竭或者其他组织器官出现新问题。移植药物是现代医学最具挑战和复杂的领域,过去30年研发有效的免疫抑制药物(ISDs)已大大提高了器官移植受体的存活率,ISDs可用于阻断不同作用机制的免疫系统,最大程度减少器官排斥反应发生的风险,如炎症、免疫力和组织修复等。但ISDs浓度过高可产生药物毒性,浓度过低会导致移植器官发生排斥。现在普遍认为,根据个体差异,制定个性化免疫抑制治疗方案是保证移植物及患者长期生存的必要条件。

3.2 ddcfDNA在IS中的研究Oellerich等[18]比较了10例肝植患者术后5～30 d血液中ddcfDNA含量与他克莫司血药浓度,发现ddcfDNA水平绝对值与他克莫司血药浓度呈负相关,且证实他克莫司最低有效浓度为6.8 μg/L,这与以往的研究结果相符合[19]。表明了ddcfDNA在检测其他免疫抑制剂的免疫抑制最低有效浓度方面可能具有广阔的应用前景。器官移植术后患者在免疫抑制剂浓度控制不理想时,为避免免疫抑制剂过量及减少不良反应会选择更换免疫抑制剂,ddcfDNA可能用于检测这些患者的免疫抑制效果。目前ddcfDNA在肝移植中的作用以及建立诊断标准和排除排斥反应的标准仍处于初级阶段[20]。由于免疫抑制剂药物的不良反应仍然是导致患者的长期预后不良的主要原因。一种非侵入性标记物来指导免疫抑制水平,并在免疫抑制管理中增加个性化免疫治疗仍然是迫切的需求,ddcfDNA可能给我们研究方向提供一种新思路。

由于肝移植体积大,肝细胞再生率高,因此与肾移植相比,肝移植中有较高的ddcfDNA含量。Schutz等[9]发表的一项前瞻性研究(n=115)报道,在移植后的前2周内,由于缺血再灌注,受者血液中有非常高的ddcfDNA释放。2周后,ddcfDNA中位数绝对值下降至≤10%。在没有丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者样本中,ddcfDNA百分率的中位数绝对值为3.3%,在HCV感染患者中,与非HCV感染患者相比,其中位水平较高,为5.9%,但仍低于10%的确定诊断或排除排斥反应的零界点。使用来自80例稳定的非HCV患者的232个样本和来自16例活检证实急性排斥反应患者的28个样本,将其与传统肝功能检测指标(天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、γ-谷氨酰转氨酶和胆红素)进行比较。ddcfDNA优于任何传统肝功能检测指标,其诊断曲线下面积为96.5%。在截断值为10%的情况下,ddcfDNA的诊断敏感性为90.3%,特异性为92.9%,在这项研究中,当稳定的HCV阳性肝移植受者与有排斥反应的肝移植受者进行比较时,ddcfDNA的诊断敏感性、特异性和曲线下面积下降,但仍优于传统的肝移植检测指标。与非HCV感染患者相比,采用23.6%的截断值,曲线下面积下降到88.2%,ddcfDNA的诊断敏感性为75%特异性为84.2%。总的来说,ddcfDNA相对于传统肝功能检测指标,其诊断移植物损伤诊断的敏感性及特异性都更高。上述研究中关于HCV阳性患者的经验可能表明,考虑到同种异体移植物损伤的无数原因,缺乏高水平的ddcfDNA可能在临床实践中更有利于作为移植物排斥的早期标记。

4 总结与展望

在过去的几年里,我们看到了在实体器官移植中关于ddcfDNA的临床研究呈爆炸式增长[17]。根据现在目前的研究结果,专家们普遍认为ddcfDNA不是异体移植物排斥反应的特异性标记物,更恰当地描述应该为评估移植物损伤严重程度的标记物,尽管这种损伤最常见的原因通常是异体移植物排斥反应,在异体移植物损伤存在时,ddcfDNA升高,似乎预示移植后不良事件。最近有报道称,将ddcfDNA加入Banff活检评分与单独行移植物活检评分相比,前者提供更好的预测[21]。有趣的是,有人认为ddcfDNA本身可能是引起移植物炎症,排斥反应的原因[22]。最后,如果ddcfDNA被证明是一个连续的生物标志物,它将会对移植受者管理提供全新的指导方向,提高移植受者的长期生存期。话虽如此,目前的数据并不能提供ddcfDNA关于连续监测在实体器官移植患者管理中的效用的明确结论。需要人们进一步进行探究其可行性。