幽门螺杆菌代谢物拮抗宿主先天免疫的机制研究

陈智 林焕雄 杨惠钿

（1.潮州市中心医院消化内科，潮州 521021；2.潮州市湘桥区中医院检验科，潮州 521000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染了世界上一半以上的人口［1］。H.pylori感染的流行率和H.pylori毒力因子的主要基因型在不同地理区域差异很大［2］。H.pylori可以在恶劣的胃环境中持续数十年，其可破坏胃黏膜并改变胃激素释放模式，从而影响胃生理。通过利用各种毒力因子，H.pylori靶向不同的细胞蛋白调节宿主先天免疫反应（包括炎症反应），并启动对胃黏膜的多次打击，导致慢性胃炎和消化性溃疡［3］。H.pylori感染的长期后果之一是胃恶性肿瘤，特别是胃癌和胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤［4］。因此，H.pylori已被国际癌症研究机构认定为Ⅰ类致癌物［5］。尽管H.pylori感染与感染部位被抑制的先天免疫之间存在密切的因果关系，但该过程所涉及的确切机制尚不明确。可以通过改变其表面分子逃避先天免疫受体的识别［6］。H.pylori还可通过抑制下游信号通路阻断其他先天识别受体。另一方面，H.pylori能够通过调节T淋巴细胞功能逃避宿主适应性免疫［7］。微生物代谢物与宿主先天免疫系统之间动态相互作用，并在维持微环境稳态和抑制炎症方面发挥关键作用［8］。然而，H.pylori的代谢物是否参与宿主的先天免疫仍未清楚。基于此，本研究旨在探讨H.pylori代谢物拮抗宿主先天免疫的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃黏膜细胞GES-1购自北京欣盛百泰科技有限公司（货号：SC135）；L-谷氨酰胺购自广州小凡科技有限公司（货号：76523-100MG）；DMEM培养基购自广州硕谱生物科技有限公司（货号：D917531-500ml）；脂多糖（LPS）购自上海源叶生物科技有限公司（货号：S11060-100mg）；H.pyloriJP26菌株受赠于中国科学院微生物所；新生小牛血清购自广州市欣福联生物科技有限公司（货号：16010-159）；TRIzol试剂购自杭州新景生物试剂开发有限公司（货号：5301100）；NF-κB荧光素酶报告载体购自YEASEN公司（货号：11501ES03）；RNeasy试剂盒购自广州誉维生物科技仪器有限公司（货号：74124）；TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒购自广州俊吉生物科技有限公司（货号：HM10001、BO60009）；IL-8 ELISA试剂盒购自北京冬歌博业生物科技有限公司（货号：DG10305H-48T）；2-D-吡喃葡萄糖（2-D-Glucopyranose，2DG）购自北京奇松生物科技有限公司（货号：BQS145219-1g）；本研究所用的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除GES-1细胞系由上海朝瑞生物科技有限公司进行敲除。TLR1、TLR2和GAPDH抗体购自Abcam公司（货号：ab68158、ab209216、ab8245）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 胃黏膜细胞GES-1培养于含有10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基。使用终浓度为100 ng/ml的LPS处理GES-1细胞。

1.2.2H.pylori的培养 在37 ℃的微需氧条件下，H.pyloriJP26菌株在布鲁氏菌肉汤液体培养基或琼脂平板上生长，辅以10%新生小牛血清。

1.2.3 RNA测序 TRIzol试剂裂解仅LPS刺激的GES-1细胞、LPS与H.pylori培养上清共同处理的GES-1细胞及未处理的GES-1细胞。使用RNeasy试剂盒提取总RNA。RNA的质量用2100 Bioanalyzer检测，定量用NanoDrop 2000检测。选择RNA完整性数（RIN）≥8的RNA样品制备文库。RNA-Seq文库使用TruSeq®RNA Library Prep Kit v2进行。在HiSeq 2500（Illumina）中对文库进行双端测序（2×150 bp）。在数据分析之前，根据3个标准去除污染的原始reads：①去除带有adapter的reads：包含超过5个adapter污染碱基的reads被认为是adapter污染的reads，将被过滤掉；②排除频率＞5%的未识别碱基的reads；③排除低质量的reads：低质量碱基数（Phred Quality 值＜19）占总碱基数15%以上的reads被视为低质量reads。剩余的reads被认为是“干净的reads”用于生物信息学分析。使用Fisher精确检验进行通路富集分析，然后使用基于KEGG通路的Benjamini & Hochberg检验，使用每个肿瘤的差异表达基因。FDR＜0.05的通路被认为是显著富集的通路。

1.2.4 NF-κB活性的检测 通过由NF-κB荧光素酶报告载体驱动的荧光素酶产生来测量H.pylori代谢物或16 h的H.pylori培养上清对NF-κB通路活性的影响。将15 μl GeneJuice在250 μl DMEM中在25 ℃下平衡 5 min，加入2 μg报告质粒并再孵育15 min，然后将混合物添加到约5×106个GES-1细胞中。立即将细胞接种于96孔板中，并使其黏附长达24 h。将H.pylori代谢物或不同浓度的2DG或LPS添加到新鲜培养基的细胞中。4～16 h后，根据制造商的说明使用商业试剂测量荧光素酶活性，并使用Wallac Victor2光度计从重复的孔中评估发光。

1.2.5 TNF-α、IL-6和IL-8分泌水平的检测 ELISA检测不同条件处理后GES-1细胞培养上清中TNF-α、IL-6和IL-8的分泌水平。

1.2.6 免疫共沉淀和免疫印迹 将2DG处理或不处理的GES-1细胞在Hanks缓冲液中充分洗涤，并用1 ml预冷的裂解缓冲液［20 mmol/L Tris（ pH=8）、137 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、2 mmol/L EDTA、10%甘油］裂解蛋白酶抑制剂PMSF（1 nmol/L）、亮肽素和抑肽酶（10 μg/ml）。裂解物以10 000 g离心5 min，收集上清液并与20 μl TLR1或TLR2抗体在4 ℃下孵育1 h。将沉淀在缺乏蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中彻底洗涤，并通过SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹上进行分析。使用抗TLR1、TLR2或GAPDH抗体孵育过夜后，以HRP偶联的羊抗兔多克隆抗体孵育1 h，进行化学发光分析。

1.2.7 非靶向代谢质谱 收集培养4 h（对照组）和16 h（实验组）的H.pylori培养上清。将含有2 μg/ml L-2-氯苯丙氨酸作为内标的1 ml提取溶液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1）加入H.pylori上清中。涡旋振荡30 s后，将样品在40 Hz频率下均质化4 min，然后在冰水浴中超声处理10 min。均质化和超声处理循环重复3次。将样品于-40 ℃下孵育1 h，并在4 ℃下以10 000 r/min离心15 min。将总共800 μl上清液转移到新的试管中，并于37 ℃的真空浓缩器中干燥，然后冰上超声处理10 min，将干燥的样品在200 μl 50%乙腈中复溶，4 ℃下13 000 r/min离心15 min，并将75 μl上清液转移到新的玻璃小瓶中进行LC/MS分析。MS原始数据文件随后由ProteoWizard转换为mzXML格式，并由R包“xcms”处理。该过程包括峰解卷积、对齐和积分。Minfrac和截止分别设置为0.5和0.3。内部MS2数据库用于代谢物鉴定。缺失值被最小值的一半填充。将数据进行log2转换，然后进行总离子电流归一化。

1.2.8 分子对接 所有分子对接研究均使用AutoDock 4.2.6软件包进行。从RCSB蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）中检索到TLR2的晶体结构（ID：6NIG）。该结构是通过添加氢原子、去除水和添加Gasteiger电荷制备的。2DG的三维结构取自chemspider（https：//www.chemspider.com/），ID为71358，通过添加氢原子和Gasteiger电荷制备。使用Propka 3.1在pH=7下测定受体蛋白和VP的质子化状态。然后将配体以默认参数对接到TLR2的结合位点，并导出20个对接结构以进行进一步的视觉分析。使用AutoDock 4.2计算每个结构的对接分数。结合自由能使用分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）方法计算。使用PyMOL 2.4.0（https：//pymol.org/2/）构建2DG与TLR2对接结果的最佳结合结构。

1.3 统计学分析 所有统计分析均使用R软件包进行。两组间比较采用双尾t检验。多组间比较采用方差分析，差异有统计学意义后，其两组间比较采用双尾t检验，P值经Bonferroni法校正。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1H.pylori代谢物抑制GES-1细胞的NF-κB通路 相较于仅LPS刺激的GES-1细胞，LPS与H.pylori培养上清共同处理后，多种基因的表达水平受到调控，并趋于未处理的GES-1细胞水平，见图1A。通路富集分析发现，上述基因主要存在于NF-κB通路，主要包括CCL2、CCL20、CCL4、CCL5、CCND1、CCNL1、CCRL2、CD44、CD69、CD80、CD83、CEBPD、CFLAR、CLCF1、CSF1、CSF2、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL2、CXCL3、CXCL6、CXCR7、CYR61、DDX58、DENND5A、FJX1、IFIH1、IFIT2、IFNGR2、IL8、IL15RA、IL18、IL1A、IL1B、IL23A、IL6、IRF1、IRS2、JAG1、JUN、KLF4、KLF6、KLF9、KYNU、LAMB3、MAP3K8、MARCKS、MCL1、NFAT5、OLR1、REL、RELA、RELB、RHOB、RIPK2、SMAD3、SNN、SOCS3、SOD2、TANK、TAP1、TNC、TNF、TNFAIP2、TNFAIP3、TNFAIP6、TNFAIP8、TNFRSF9、TNFSF9、TNIP1、TNIP2、TRAF1，存在于NF-κB通路的下游，见图1B。LPS与H.pylori培养上清共同处理后，NF-κB通路的活性受到抑制（P＜0.05，图1C）。使用3KD超滤管过滤H.pylori培养上清，并采用过滤的滤液（代谢物部分）和截留的溶液（蛋白部分）处理LPS刺激的GES-1细胞，发现3KD超滤管过滤的滤液（代谢物部分）能够抑制NF-κB通路活性（P＜0.05，图1D）。此外，H.pylori代谢物能够抑制NF-κB的磷酸化，见图1E。同时，H.pylori代谢物能够抑制NF-κB通路效应因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌（P＜0.05，图1F～H）。

图1 幽门螺杆菌代谢物抑制GES-1细胞的NF-κB通路Fig.1 Helicobacter pylori metabolites inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.2 2 DG抑制GES-1细胞的NF-κB通路 将H.pylori代谢物进行非靶向代谢质谱，相比于对照组（培养4 h的H.pylori代谢物），培养16 h的H.pylori代谢物中有32种满足以下条件：①表达上调；②具有统计学意义，见图2A。在LPS处理的同时，将上述代谢物以5 μmol/L处理GES-1细胞，发现2DG处理后，GES-1细胞中NF-κB通路活性受到抑制（图2B）。在LPS处理的同时，使用1、5、25 μmol/L 2DG处理后，GES-1细胞中NF-κB通路活性均受到抑制（图2C）。在LPS处理的同时，1、5、25 μmol/L 2DG处理后，GES-1细胞中NF-κB通路效应因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌受到抑制（P＜0.05，图2D～F）。在LPS处理的同时，1、5、25 μmol/L 2DG均可抑制NF-κB的磷酸化，见图2G。

图2 2DG抑制GES-1细胞的NF-κB通路Fig.2 2DG inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.3 2 DG拮抗宿主TLR2分子抑制NF-κB通路识别细菌刺激的先天免疫系统主要是TLR受体家族，且TLR受体家族是NF-κB通路的上游。因此，本研究构建了TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的胃黏膜细胞GES-1细胞系。使用LPS处理后，相对于对照组（Parent组），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1细胞中NF-κB活性显著降低（P＜0.05）；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的GES-1细胞中NF-κB活性无显著变化。在LPS处理的同时使用2DG或H.pylori培养上清处理后，TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的GES-1细胞中NF-κB活性显著降低（P＜0.05）；而TLR1和TLR2敲除的GES-1细胞中NF-κB活性无显著变化（图3A）。使用2DG处理后，GES-1细胞中TLR1和TLR2的相互作用均减弱（图3B、C）。通过分子对接发现，2DG能够与TLR2氨基酸残疾R321、K347、F349结合，结合能为-12 kcal/mol（图3D）。构建TLR2野生型和突变型质粒（R321K、K347R、F349A），并分别转染TLR2敲除的GES-1细胞，在LPS处理的同时使用2DG或H.pylori培养上清处理后并不能减少转染TLR2突变型GES-1细胞的NF-κB活性（图3F）。

3 讨论

在本研究中，H.pylori代谢物2DG能够抑制NF-κB通路活性，抑制NF-κB磷酸化，抑制NF-κB通路效应因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌。有研究发现，H.pylori利用Ⅳ型分泌系统（T4SS）将CagA注入宿主胃上皮细胞，并通过激活NF-κB通路诱导炎症反应［9］。CagA是一种蛋白，应在3KD超滤管过滤的截留的溶液中（蛋白部分）。但本研究的蛋白部分不能影响NF-κB通路的活性，而代谢物2DG抑制了NF-κB通路。不同H.pylori菌株之间存在异质性。在许多非洲国家发现H.pylori感染率高，但H.pylori相关疾病发病率低［10］。因此，本研究所使用的H.pyloriJP26可能并不表达CagA蛋白。研究发现，在接种H.pylori后第1天，小鼠NF-κB活性和炎症反应显著上升［11］。然而，在接种H.pylori后第30天或第135天，胃中NF-κB活性水平下降。因此，H.pylori急性感染和长期感染时，NF-κB活性水平有所差异。本研究所用的是体外培养的H.pylori，其抑制NF-κB活性的代谢物2DG是否在H.pylori长期感染中抑制NF-κB活性值得进一步探讨。

在本研究中，使用LPS处理后，相对于对照组（Parent组），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1细胞中NF-κB活性显著降低；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的胃黏膜细胞GES-1细胞中NF-κB活性无显著变化。Toll样受体（TLR）家族蛋白通过识别多种微生物分子（包括脂蛋白、脂肽、脂多糖、鞭毛蛋白和核酸）中的保守模式在先天免疫中发挥关键作用［12］。研究表明，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10能够识别细菌的模式识别受体，而TLR3、TLR7、TLR是识别病毒的基因组［13］。因此，TLR3、TLR7、TLR8敲除后，细菌独有物质LPS刺激下NF-κB的活性水平无显著差异。

TLR2与TLR1结合对于识别细菌脂蛋白和脂肽至关重要［14］。这些脂蛋白通过由脂质链修饰的保守N末端锚定在细胞膜上，并在巨噬细胞中诱导强烈的促炎信号［15］。TLR2缺陷小鼠对脂蛋白无反应，更容易患金黄色葡萄球菌引起的败血症、肺炎链球菌和单核细胞增生李斯特菌引起的脑膜炎，以及结核分枝杆菌感染［16］。因此，TLR2在细菌诱导的炎症反应中具有不可或缺的作用。本研究发现2DG能够与TLR2氨基酸残疾R321、K347、F349结合。研究发现，TLR1和TLR2胞外域的异二聚化是介导NF-κB通路活化所必需的［17］。TLR1和TLR2氨基酸形成疏水、氢键和离子相互作用，稳定蛋白质异二聚体。其中，TLR2的R321会与TLR1的E321和E366形成离子键，TLR2的K347会与TLR1的T361和T363形成氢键，TLR2的F349会与TLR1的Y320和V339形成疏水键。因此，2DG打断了这些键的形成，减少了TLR1和TLR2的相互作用，使TLR1-TLR2的异源二聚体不稳定，抑制了NF-κB通路活化。

综上所述，H.pylori代谢物2DG能够与TLR2相互作用，减少TLR2与TLR1异源二聚体的形成，抑制先天免疫NF-κB通路活性。