鸽毛滴虫病诊断及疫苗研究进展

张春平

鸽毛滴虫病，又称为口腔炎症，是鸽群常见的一种以口腔、咽喉为典型发病部位的寄生虫病[1]。其病原为鸽毛滴虫（Trichomonas gallinae），属原生动物门单细胞原虫，能够通过口腔进入鸽体内，感染消化道及呼吸道[2]，引起患病鸽食欲下降，精神萎靡；严重者，虫体可进入内脏，形成不同器官的病灶，进而影响患病鸽的生存；并且鸽一旦感染毛滴虫，易造成其他疾病的混合感染，其中以幼龄鸽发病及死亡率为最高[3]。

1  流行病学

鸽毛滴虫在全世界广泛分布[4]，主要通过接触性传播，各年龄段鸽群均可感染。其中成年鸽感染毛滴虫后大多不发病，呈带虫传播，最终可使鸽群大面积感染。而幼鸽由于其免疫功能不完善，其感染后发病率及死亡率都较高，青年鸽次之。国外部分地区鸽毛滴虫感染率高达75.78%[5]。在我国影响较大的主要是山东、广东、河北等肉鸽养殖量大的省份。2006年广东省11家鸽养殖场的毛滴虫感染情况调查结果显示，65.8%的鸽子感染毛滴虫[6]。而2008年四川地区2万只鸽子的调查结果显示，其毛滴虫平均感染率高达75.12%[7]。山东省2016年的调查结果显示，鸽群毛滴虫平均阳性率在14.9%～31.1%之间[8]，而2006年该地区阳性率超过60%，鸽毛滴虫的感染率有所下降，分析主要原因是对疾病的重视、科学喂养及药物的合理使用。近年来由于甲硝唑的限用及耐药性的产生，各地感染率有所反弹。

2  诊断

毛滴虫病是危害鸽子养殖经济的主要疾病之一，其发病率高、传染性较强，严重制约鸽养殖产业的发展。通常养殖户对发病鸽的诊断，仅仅停留在临床症状的初步判断阶段，由于病症相对于感染的滞后性，存在着发现不及时、淘汰不彻底的情况，极易造成重大的经济损失。因此市场上需要一种高效、便捷、低成本的检测手段，能够定期对鸽群进行早期的诊断筛查，提高养殖效率，降低养殖成本。而现阶段的研究结果仍无法形成高效稳定的检测产品。

2.1  镜检法

镜检法是最直观的毛滴虫检测法，通常被视为其他检测方法的判定标准。将灭菌棉签用生理盐水浸湿后，插入鸽口腔或嗉囊内取样；然后在载玻片上滴一小滴生理盐水，将采样棉签在生理盐水中晃动数次；将载玻片直接置于光学显微镜下进行观察。可通过毛滴虫的梨形形态、具有鞭毛以及典型的滚动运动的波动膜进行分辨[9]。但该检测方法灵敏度较低，需要检测样本中大量存在的病原，且存在采样部位、采样手法有差异，在感染初期容易造成假阴性的结果。

2.2  培养-镜检法

此法可视为镜检法的扩大效应方法，孙炎戊等[10]将经直接镜检法检测后的鸽口腔粘液样品棉签放入肝浸肉汤培养液中，折断棉签后，置于37 ℃生化培养箱中恒温培养12 h，吸取培养液5～10 L，放于光学显微镜下10×10倍镜检，镜检有活动的梨形或椭圆形虫体即可判定为毛滴虫感染阳性，否则为阴性。相比直接镜检法，此方法检出率显著提升（20%～38.3%），且阳性样本毛滴虫虫体数量明显增多，可见大量毛滴虫在游动，活性良好。但此方法对于操作人员、仪器、环境要求较高，且耗费时间较长，不适宜于大规模临床应用。

2.3   Dot-ELISA方法

罗峰等[11]建立了斑点酶联免疫吸附试验定性检测鸽毛滴虫抗原的检测方法，采用抗原抗体结合的原理进行毛滴虫检测。70个样品中，48个镜检阳性样品用本方法检测有44个呈阳性，阳性符合率为91.7%；22个镜检阴性样品用本方法检测有12个呈阴性，阴性符合率为54.5%。结果表明，本方法建立的斑点酶联免疫吸附与镜检结果的总符合率为80%，但由于其操作程序复杂，成本高，假阳性较多，仍需进一步优化以适用于大规模临床检测。

2.4  分子诊断技术

现代分子生物学的深入研究，使得疾病的检测手段有着日新月异的变化，能够更好地解决过去诊断方法的弊端。目前，用于鸽毛滴虫检测的分子生物学手段主要为聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）。Robinson等[12]针对禽毛滴虫SSU rRNA基因进行巢式PCR，在英国雀类中成功检测出毛滴虫病原，开启了禽毛滴虫SSU rRNA基因研究。Solís等[13]针对SSU rRNA基因，建立了SYBR绿色实时荧光定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法，对禽毛滴虫进行定量检测。除此之外，还有包括FeHyd基因等多种分子标志物可用于毛滴虫的诊断，但市场上尚缺少特异性更强、重复性更好及敏感度更高的靶标用于研发鸽毛滴虫的早期筛查产品。

3  疫苗研究进展

随着鸽养殖业的不断发展，疾病对其影响越发显著。由于鸽毛滴虫病发病率高，传染性强，且检测手段不成熟，一旦鸽群出现症状，此时治疗或淘汰均易造成重大经济损失，因此，疫苗的研究迫在眉睫。毛滴虫属于寄生虫，区别于病毒和细菌，寄生于细胞中，且具有生活史，免疫系统难以清除，因此寄生虫疫苗的开发相较于病毒和细菌难度更大，目前尚无成熟的毛滴虫疫苗产品上市，但部分灭活疫苗及亚单位疫苗被证实有一定的免疫保护效果。近年来，研究者对于疫苗的研发力度持续增加，一些有希望能成为疫苗候选靶标的蛋白被广泛研究。

3.1  滅活疫苗

罗峰[14]等将鸽毛滴虫进行体外培养，扩增达到一定数量后进行超声破碎灭活，稀释后加入油佐剂乳化成油包水剂型疫苗，用以免疫鸽子。两次免疫后抗体水平显著提升，对带虫鸽、健康鸽均有较强的免疫刺激作用。使用毛滴虫强毒株攻毒后免疫组未发生死亡，相比之下对照组死亡率为18.7%。此结果证明了全虫的灭活疫苗可以一定程度上保护健康鸽、带虫鸽，可减少毛滴虫的感染。但此方法中全虫的破碎率有待研究，若破碎不全可能会因活虫残留而造成大范围感染的问题，后续研究应重点考虑其安全性及质量控制方面的问题。

3.2  亚单位疫苗

亚单位疫苗，尤其是体外表达重组亚单位疫苗，作为基因工程疫苗的重要手段，其优势为体外构建含有目标抗原的重组表达系统，通过体外表达纯化后制备成疫苗，高效且质量易于控制。粘附蛋白是毛滴虫病原的一种重要的致病性功能蛋白，此类蛋白主要起到粘附作用，结合宿主细胞并帮助病原逃避宿主的免疫系统。其中研究最为广泛的为AP33基因，罗锋等[15]通过大肠杆菌表达系统成功表达了鸽毛滴虫AP33基因，并进行攻毒保护性试验，结果表明该方法中制备的鸽毛滴虫AP33重组亚单位疫苗能够刺激机体产生特异性中和抗体，保护率高达100%，证明鸽毛滴虫粘附蛋白AP33基因可以作为基因工程疫苗的候选靶标。

张帅[16]根据阴道毛滴虫G3蛋白部分基因序列ORF设计引物，经PCR成功扩增获得鸽毛滴虫G3蛋白基因序列，通过原核表达载体构建重组表达菌株，获得重组蛋白，制备成疫苗后免疫小鼠，收获的抗体可识别该蛋白，免疫原性较好，但尚缺少抗体对病原的中和活性研究及靶动物攻毒保护性实验数据，暂无法判断其是否可作为疫苗的候选靶标。

3.3  表位肽疫苗

表位肽疫苗是基于亚单位疫苗进一步优化，利用结构生物学等学科对抗原结构进行解析，找到蛋白结构域，并预测其中起到关键作用的一系列抗原表位肽段，将其串联构建于表达系统中进行表达，纯化后制备成疫苗。与亚单位疫苗相比，表位肽疫苗的靶向性更强，机理更为清晰，干扰性较少，免疫原性更为突出。陈文杰等[17]对粘附蛋白AP33进行软件分析，研究其二级结构、特性及抗原表位位点，尤其是B细胞表位及T细胞表位，后续的目标是将上述表位排列组合、串联甚至重复串联，通过原核表达或真核表达系统进行重组表达后制备成疫苗，以期具有更强的免疫原性。

4  展望

我国鸽养殖业蓬勃发展，疾病防控问题愈发重要。目前，鸽毛滴虫感染严重且危害鸽养殖经济的健康发展。研究表明目前的通用药物甲硝唑易于残留，对人类有一定副作用，因此被限制使用（肉鸽中不可检出）。随着甲硝唑等药物的大肆滥用，以及鸽毛滴虫强大的繁殖能力，虫体的耐药性显著增强；随着虫体的快速、大量繁殖，未来出现超级耐药虫株的可能性大大增加，这将给养殖业带来毁灭性的打击。因此对于毛滴虫的防控应采取以预防为主、淘汰为辅的净化方针。目前，鸽毛滴虫病暂无商业化疫苗上市，现有的各种疫苗研究报道中同样存在一些尚待解决的问题，未来仍需进一步研究更具中和活性的靶标，并致力于解决疫苗安全、有效、质量可控的诸多问题。

参考文献：

[1]  梁冰冰，尉啸涵，李复煌，等．中国鸽毛滴虫病的流行规律及中西医防治措施[J/OL]．中国动物传染病学报[2021-03-01]..https：//doi.org/10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.20220302.006.

[2]  崔洪文.科学防治肉鸽三类寄生虫病[J].家禽科学，2013（01）：38-38+2.

[3]  田立波.鸽子的毛滴虫病[J].现代畜牧兽医，2005（5）：47.

[4]  Spriggs M C，Purple K E，Gerhold R W.Detection of Trichomonas gallinae in Wild Birds Admitted to a Rehabilitation Center，Florida，USA[J]. J Wildl Dis， 2020，56（3）：733-735.

[5]  Gulegen E.， Senlik B.，Akyol V..Prevalence of trichomoniasis in pigeons in Bursa province，Turkey[J].Indian Vet. J.，2005，82：369-370.

[6]  罗锋，翁亚彪，张腱菲，等.广东省鸽毛滴虫感染情况的调查[J].中国家禽，2006，28 （17）：24-25.

[7]  黄名英，廖党金，傅安静.四川鸽毛滴虫病调查和鸽毛滴虫体外保存方法[J].西南农业学报，2009，22（1）：192-196.

[8]  Jiang X，Sun J，Wang F，et al.Prevalence of Trichomonas species in domestic pigeons in Shan-dong Province，China，and genotyping by restriction fragment len-gth polymorphism [J].The Veterinary Journal，2016，211：88-93.

[9]  韩涛，杨会国，刘佳佳，等.鸽毛滴虫病的诊断与防治[J].畜牧兽医科技信息，2021（01）：198-199.

[10]  孙炎戊，戴雁云，陈思彤，等.三种鸽毛滴虫检测方法的比较分析[J].养禽与禽病防治，2021（10）：10-13.

[11]  罗锋，郭炳新，李国清，等.鸽毛滴虫感染Dot-ELISA检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2010，46（10）：18-20.

[12] Robinson RA，Lawson B，Toms MP，et al. Emerging infectious disease leads to rapid population declines of common British birds.PLoS One，2010，5（8）：e12215.

[13]  Rentería-Solís Z，Nguyen-Ho-Bao T，Taha S，et al. A SYBR green I real-time polymerase chain reaction （PCR） assay for detection and quantify-cation of Trichomonas gallinae[J].Parasitology Research， 2020，119（11）：3909-3913.

[14]  羅锋，李国清.鸽毛滴虫全虫疫苗免疫效果研究[J].养禽与禽病防治，2017（5）：5-7．

[15]  罗锋，李国清，苏遂琴，等.鸽毛滴虫粘附蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其免疫保护试验[J].中国科技论文在线，2010.

[16]  张帅.鸽源禽毛滴虫G３蛋白克隆、原核表达及免疫原性鉴定[D].泰安：山东农业大学，2017.

[17]  陈文杰，杭柏林，刘保国，等.鸽毛滴虫黏附蛋白AP33的理化特性与抗原性分析及细胞表位预测[J].江苏农业科学，2020，48（24）：163-167.