美拉德反应修饰紫苏蛋白及其抗氧化活性研究

宋彦显 李胜强 闵玉涛

摘要：以紫苏饼粕为原料，采用碱溶酸沉法提取蛋白，以糖为修饰剂，以DPPH自由基清除率为考察指标，通过单因素实验、响应面分析法优化制备紫苏蛋白美拉德反应修饰产物工艺，研究其抗氧化活性。结果表明，在料液比1∶12、碱溶pH 9.0、 50 ℃、溶解40 min、酸沉pH 4.4条件下，提取的紫苏蛋白纯度达69.9%。单因素实验制备糖-紫苏蛋白美拉德反应产物的最适工艺为最适糖种类为木糖、紫苏蛋白于100 ℃加热4 h，紫苏蛋白与木糖最适质量比15∶1，初始pH 9.0。响应面优化结果显示各因素对抗氧化能力影响的主次顺序为起始pH值＞紫苏蛋白与木糖的质量比＞反应时间；结合实际，其最佳工艺为初始pH 8.2、反应时间4.85 h、紫苏蛋白与木糖的质量比15∶1，此时对DPPH自由基的清除率达55.3%，与预测值54.18%接近，紫苏蛋白美拉德反应产物有较好的抗氧化活性。

关键词：紫苏蛋白;美拉德反应;抗氧化活性;响应面分析法

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0095-07

Modification of Perilla Protein by Maillard Reaction and Its Antioxidant Activity

Abstract： With perilla seed meal as the raw material， protein is extracted by alkali-extraction and acid-precipitation method. With sugar as the modifier and DPPH free radical scavenging rate as the investigation index， single factor experiment and response surface analysis method are used to optimize the preparation process of perilla protein product modified by Maillard reaction and their antioxidant activity is studied. The results show that the purity of extracted perilla protein reaches 69.9% when the solid-liquid ratio is 1∶12， the alkali-extraction pH is 9.0， 50 ℃， dissolution time is 40 min， and acid precipitation pH is 4.4. The optimal process for preparing sugar-perilla protein Maillard reaction products by single factor experiment is as follows： the optimal sugar type is xylose， perilla protein is heated at 100 ℃ for 4 h， the optimal mass ratio of perilla protein to xylose is 15∶1， and the initial pH is 9.0. Response surface optimization results show that the primary and secondary order of the effects of the factors on the antioxidant capacity is initial pH value>the mass ratio of perilla protein to xylose>reaction time. Combined with the actual conditions， the optimal process is initial pH of 8.2， reaction time of 4.85 h and the mass ratio of perilla protein to xylose of 15∶1， at this time， the DPPH free radical scavenging rate reaches 55.3%， close to the predicted value of 54.18%. Perilla protein Maillard reaction products have good antioxidant activity.

Key words： perilla protein; Maillard reaction; antioxidant activity; response surface analysis method

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt.]是唇形科紫苏属一年生直立草本药食同源植物，又名白苏、荏子、香苏等，在我国已有2 000多年的种植和食用历史[1]。紫苏适应环境能力强，生长速度快，分布范围广，在我国大部分地区以及东南亚、美国、俄罗斯等地均有种植[2]。紫苏含有多糖、黄酮、多酚、多种人体必需的微量元素、α-亚麻酸和ε-3脂肪酸等生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、消炎和抑制黑色素生成等生物活性[3-9]。紫苏浑身是宝，营养丰富，叶、茎和籽均可入食，其香味浓郁宜人，常用于食品调味，也可用于油用、香料和药用等。尽管紫苏种植起源于我国，但我国对紫苏的研究和开发利用落后于美国和俄罗斯等国家，以低级油制产品为主，精深加工技术极度缺乏，产品开发系统性和竞争力亟待提升。

紫苏粕是紫苏籽榨油后的副产物，蛋白含量可达32.33％，含有18种氨基酸，包括8种人体必需的氨基酸，是优质的植物全蛋白资源，在蛋白食品的功能开发方面具有较广阔的应用前景[10-11]。紫苏粕长期以来主要用于动物饲料或还田作农肥，不仅造成蛋白资源的浪费，而且污染了环境，因此，有效利用紫苏粕资源、开发紫苏蛋白产品十分必要。

蛋白质中含有多种氨基酸，能与还原糖发生多种氨基酸-糖模型体系的美拉德反应，反应产物能使自由基链断裂，从而具有清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧自由基和体外螯合铁的功能。林晓彤等[12]采用美拉德反应改性虾壳蛋白质，制备的美拉德反应产物具有一定的还原能力，约为58 μmol Trolox 當量/g。董烨等[13]发现，美拉德反应显著提高了鳙鱼皮水解物的抗氧化活性，核糖美拉德反应产物的抗氧化活性最高。黄建蓉等[14]发现，酪蛋白-葡萄糖美拉德反应产物对DPPH自由基的清除率与浓度具有良好的量效关系。丁小强等[15]利用鱼糜漂洗液回收的蛋白酶解物与葡萄糖发生美拉德反应，结果表明其羟基自由基清除能力显著提高，ABTS自由基清除能力和还原力也有所提高。诸多研究表明，蛋白质的美拉德反应修饰产物可显著提高抗氧化能力，是蛋白天然抗氧化剂开发的方向之一。

目前，紫苏粕的研究主要聚焦在蛋白的提取制备、结构和功能特性以及制备抗氧化肽、鲜味肽、抗菌肽。Kim等[16]研究了不同蛋白水解酶对紫苏籽粕蛋白水解产物的功能性质和生物活性的影响。Zhao等[17]从油籽残渣中提取的紫苏分离蛋白具有良好的功能性能，可作为潜在的食品级乳化剂用于皮克林乳化剂的制备。王丽娜等[18]利用紫苏蛋白结合其他蛋白制作植物蛋白产品，使产品具有香味，提高产品的口感、风味、色泽和组织化程度。Zhang等[19]发现紫苏粉蛋白水解后可得到具有较高抗氧化活性的多肽。姜文鑫等[20]制备紫苏抗菌肽，发现其对沙门杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用。目前，关于紫苏粕蛋白美拉德反应修饰产物的抗氧化活性的报道尚不多见。

本文以紫苏饼粕为原料提取蛋白，以DPPH自由基清除率为考察指标，通过单因素实验、响应面分析法优化紫苏蛋白美拉德反应修饰产物制备工艺，研究其抗氧化活性，为天然抗氧化剂的开发和紫苏饼粕蛋白基功能性食品的研究提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

紫苏粕：天津宝士科技有限公司，蛋白含量25%；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯）：福州飞净生物科技有限公司；考马斯亮蓝、牛血清蛋白（均为分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；D-木糖（分析纯）：惠兴生化试剂有限公司；D-果糖（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HH-S数显恒温水浴锅 金坛市正基仪器有限公司；80-3大容量离心机 江苏金坛市中大仪器厂；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；FA2204B电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司；LGJ-10C冷冻干燥机 四环科仪科技发展河北有限责任公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 盐城市安信实验仪器有限公司；FT-IR红外分光光度计 PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 紫苏粕蛋白质的提取与浓度的测定

1.3.1.1 碱溶酸沉法提取紫苏蛋白

取紫苏粕粉末于烧杯中，加适量石油醚，不时搅拌，期间换石油醚溶液一次，萃取24 h，萃取脱去紫苏粕中脂肪，下层的固体于通风橱内干燥备用。准确称取500 g干燥后的紫苏粕粉末于烧杯中，按料液比为1∶12加入蒸馏水，用NaOH溶液调节pH至9.0， 50 ℃，碱溶40 min，期间不时搅拌。然后以6 000 r/min离心20 min，取上清液，用盐酸溶液调节pH至4.4（紫苏蛋白的等电点），沉淀蛋白，再次离心，取下层固体即为紫苏蛋白，将紫苏蛋白冷冻干燥，干燥后在冰箱内保存备用。

1.3.1.2 牛血清蛋白标准曲线的制备

分别吸取0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL牛血清蛋白标准溶液于比色管中，再用蒸馏水补至2 mL，用0 mL管作为调零管，再分别加入10 mL考马斯亮蓝试剂迅速混匀，反应10 min后在595 nm处测吸光值。以吸光值（Abs）为纵坐标、蛋白质浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，并求得该标准曲线的线性回归方程。

1.3.1.3 紫苏粕蛋白质提取液浓度的测定

配制1 mg/mL的样品溶液，吸取1 mL样品溶液于比色管中，快速加入考马斯亮蓝5 mL，混匀，室温下反应5 min，在595 nm处测吸光值。按照公式（1）计算蛋白质浓度：

蛋白质浓度（%）=CD/W×100%。（1）

式中：C为根据标准曲线得到的样品中蛋白质浓度，μg/mL；D为样品溶液的稀释倍数；W为样品质量，μg。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照郑志强等[21]的方法并略作调整。3 mL蒸馏水加3 mL无水乙醇为调零，将3 mL稀释后的样品溶液添加到3 mL 200 μmol/L DPPH自由基溶液中，振荡混匀，室温下避光反应30 min，测定517 nm处的吸光值，按照公式（2）计算DPPH自由基清除率：

式中：A1为3 mL DPPH自由基溶液加3 mL蒸馏水在517 nm处的吸光值；A2 为3 mL样品溶液加3 mL DPPH自由基溶液在517 nm处的吸光值；A3为3 mL样品溶液加3 mL无水乙醇在517 nm处的吸光值。

1.3.3 紫苏蛋白美拉德反应产物的制备及单因素实验

1.3.3.1 紫苏蛋白美拉德反应产物的制备

分别取一定量木糖和紫苏蛋白样品于25 mL具塞试管中，加入蒸馏水至刻度，调节pH至9.0，使紫苏蛋白全部溶解，用试管夹固定在水浴锅上，于水浴锅中加热进行美拉德反应，加热一定时间，取一定量样品于试管中，将试管在冰水中进行冷却，终止反应，所得产物即为美拉德反应产物。

1.3.3.2 不同糖对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

按照紫苏蛋白与糖的质量比为1∶1称取22.5 mg紫苏蛋白样品与等质量葡萄糖、果糖、木糖分别于3支具塞试管中，加入蒸馏水至25 mL，调节pH至9.0，溶解蛋白。加固試管塞，于 90 ℃恒温水浴加热。分别在反应0，1，2，3，4，5，6 h时取1 mL样品于试管中，将试管放在冰水中冷却，终止反应。再分别加入10 mL蒸馏水稀释，即为样品溶液。以DPPH自由基清除率为指标，确定葡萄糖、果糖、木糖与紫苏蛋白发生美拉德反应的最适糖种类和最适反应时间。

1.3.3.3 不同温度对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

按照紫苏蛋白与糖的质量比为1∶1，分别称取24.2 mg紫苏蛋白样品与等质量木糖于3支具塞试管中，加蒸馏水至25 mL，调节pH至9.0，溶解蛋白。加固试管塞，分别在80，90，100 ℃恒温水浴加热。在加热反应进行1，2，3，4 h时取1 mL样品于试管中，将试管放在冰水中冷却，终止反应。再分别加入10 mL蒸馏水稀释，即为样品溶液。以DPPH自由基清除率为指标，确定木糖与紫苏蛋白发生美拉德反应的最适温度。

1.3.3.4 不同初始pH对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

按照紫苏蛋白与糖的质量比为1∶1，分别称取25.0 mg紫苏蛋白样品与等质量木糖于3支具塞试管中，加蒸馏水至25 mL，分别调节pH至8.0，9.0，10.0。加固试管塞，于100 ℃恒温水浴加热。在加热反应进行1，2，3，4 h时取1 mL样品于试管中，试管放在冰水中冷却，终止反应。再分别加入10 mL蒸馏水稀释，即为样品溶液。以DPPH自由基清除率为指标确定木糖与紫苏蛋白发生美拉德反应的最适初始pH。

1.3.3.5 不同蛋白质与糖的质量比对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

按照紫苏蛋白与木糖的质量比为10∶1、15∶1、20∶1分别称取紫苏蛋白样品与等质量木糖于3支具塞试管中，加蒸馏水至25 mL，调节pH至9.0，溶解蛋白。加固试管塞，于100 ℃恒温水浴加热。在加热反应进行1，2，3，4 h时取1 mL样品于试管中，试管放在冰水中冷却，终止反应。再分别加入10 mL蒸馏水稀释，即为样品溶液。以DPPH自由基清除率为指标确定木糖与紫苏蛋白发生美拉德反应的最适紫苏蛋白与木糖的质量比。

1.3.4 响应面分析实验设计

在单因素实验的基础上，以DPPH自由基的清除能力为响应值，选取初始pH（A）、反应时间（B）、紫苏蛋白和木糖比例（C）为考察变量，应用Design-Expert 12.0软件，按照Box-Behnken实验设计原理建立三因素三水平的实验设计表，见表1。

2 结果与分析

2.1 紫苏粕蛋白提取液浓度的测定

以测得的吸光值（Y）为纵坐标，以蛋白质浓度（X，μg/mL）为横坐标，作线性回归方程，见图1。

由图1可知，标准曲线方程为Y=0.121 1X－0.033 6，R2=0.992，吸光值和牛血清蛋白标准溶液有良好的线性关系。根据标准曲线方程计算得出紫苏蛋白提取液中蛋白质含量，测得吸光值Y=0.051，X=0.699，即样品中的蛋白质含量为69.9%。蛋白含量偏低，原因可能是调节pH的过程中产生的偏差，pH不准确，则紫苏蛋白溶解不充分，造成蛋白含量较低；在离心的过程中，离心时间偏短，导致上层蛋白质溶液含有一些杂质，造成蛋白质含量偏低。

2.2 单因素实验优化紫苏蛋白美拉德反应产物的制备工艺

2.2.1 不同糖对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

分别以葡萄糖、果糖、木糖为修饰剂，制备紫苏蛋白美拉德反应产物，以加热时间为横坐标、DPPH自由基清除率为纵坐标，不同糖对抗氧化活性的影响见图2。

由图2可知，木糖与紫苏蛋白发生美拉德反应，其产物的抗氧化活性最高，在1～4 h内，随着加热时间的增加，DPPH自由基清除率随之增大，在4 h时达最大值。继续加热，产物的抗氧化活性反而降低。葡萄糖与紫苏蛋白美拉德反应产物的抗氧化活性高于果糖，在1～3 h内随着加热时间的增加葡萄糖与果糖，美拉德反应值产物的DPPH自由基清除率随之增大，在3 h时达最大。继续加热，产物的抗氧化活性随之降低。木糖是五碳糖，葡萄糖和果糖是六碳糖，在理论上五碳糖美拉德反应程度大于六碳糖美拉德反应程度，还原糖美拉德反应程度大于酮糖美拉德反应程度，葡萄糖美拉德反应程度大于果糖美拉德反应程度，木糖更适于美拉德反应，符合实验结果。

2.2.2 不同温度对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

分别以80，90，100 ℃为反应温度，制备紫苏蛋白美拉德反应产物，以加热时间为横坐标、DPPH自由基清除率为纵坐标，作图比较3种反应温度下制备的紫苏蛋白美拉德反应产物的抗氧化活性，见图3。

由图3可知，各温度条件下，在1～4 h内，随着时间的增加，抗氧化活性随之增大。随着温度的升高，产物的抗氧化活性提高，当温度达100 ℃时，抗氧化活性最大，且100 ℃＞90 ℃＞80 ℃，温度相差10 ℃，美拉德反应程度相差很多倍。美拉德反应在20～25 ℃就会发生，在一定范围内，温度越高，越有利于美拉德反应的发生，美拉德反应程度越大，产物越多，产物的抗氧化活性越高。温度过高，超过180 ℃，则会产生致癌物质。结合实验室条件选择美拉德反应的最适温度为100 ℃。

2.2.3 不同初始pH对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

分别以初始pH 8.0，9.0，10.0制备紫苏蛋白美拉德反应产物，以加热时间为横坐标、DPPH自由基清除率为纵坐标，作图比较3种初始pH下制备的紫苏蛋白美拉德反应产物的抗氧化活性，见图4。

向冷冻干燥后的紫苏蛋白样品中加入蒸馏水，使其溶解。紫苏蛋白样品的溶解度较低，这是因为紫苏蛋白是在碱性条件下溶解出来、在等电点时沉淀得到的，远离等电点才能溶解，因此紫苏蛋白样品经过加碱后才能完全溶解。在偏碱环境下有利于美拉德反应的进行，但过碱环境则适得其反。由图4可知，pH为9.0时，反应产物的抗氧化活性最高，pH为8.0时的清除率大于pH为10.0时的清除率，这是由于pH为10.0时为过碱环境，对紫苏蛋白与木糖发生的美拉德反应产生不利影响。在进行美拉德反应的过程中，反应体系的pH呈逐渐下降的趋势，下降到一定程度停止。因此，选择pH 9.0为起始反应pH值。

2.2.4 不同蛋白与糖的质量比对紫苏蛋白美拉德反应产物抗氧化活性的影响

分别按照紫苏蛋白与木糖的质量比为10∶1、15∶1、20∶1制备紫苏蛋白美拉德反应产物，以加热时间为横坐标、DPPH自由基清除率为纵坐标，作图比较3种蛋白与糖比例的紫苏蛋白美拉德反应产物的抗氧化活性，见图5。

蛋白质中的氨基和糖分子中的羰基发生缩合反应，由于蛋白质的分子量较大，在蛋白质和糖的质量相同的情况下，糖分子中的羰基比蛋白质中的氨基多，因此蛋白质的质量要比糖的质量大一些，才有足够的氨基与糖分子中的羰基发生缩合反应，美拉德反应才能更好地发生。由图5可知，当紫苏蛋白和木糖的质量比为15∶1时，自由基清除率最大，且在1～4 h内呈持续上升的趋势，而紫苏蛋白和木糖的质量比为10∶1和20∶1时相对较小。紫苏蛋白和木糖的质量比为10∶1时，自由基清除率曲线呈先下降后上升的趋势，在加热3 h时达到最大，随后又降低。紫苏蛋白和木糖的质量比为20∶1时，自由基清除率呈先上升后下降的趋势，在加热2 h时达到最大。因此，选择紫苏蛋白和木糖的质量比为15∶1。

综上所述，单因素实验制备糖-紫苏蛋白美拉德反应产物的最适工艺为最适糖种类为木糖，紫苏蛋白于100 ℃加热4 h，蛋白与木糖最适质量比15∶1，起始pH 9.0。

2.3 响应面分析实验优化紫苏蛋白美拉德反应产物制备工艺

2.3.1 响应面模型分析

根据响应面实验结果采用Design-Expert 12.0软件对实验数据进行三因素三水平的响应面分析实验，结果见表2。对数据进行显著性检验和方差分析，见表3。

由表2和表3可知，对设计方案中17 组实验数据进行多元回归拟合，获得紫苏蛋白美拉德反应产物DPPH自由基清除能力的二次多项回归方程：Y=57.13－10.58A+1.96B+9.60C+1.77AB+9.73AC－0.45BC－9.88A2－7.49B2－9.29C2。该实验所建立的回归模型的P值为0.000 1，具有高度显著性，失拟项的P值为0.087 2，不显著，说明无失拟因素存在，该回归模型的预测值与实测值的拟合水平较好，所选模型较适宜。回归系数R2 为0.971 8，表明该模型相关度较好，RAdj2为0.935 6，表明该模型可以解释93.56%的DPPH自由基清除能力的变化，即大多数变异可以被该模型预测，进一步说明了回归方程的拟合度较好，实验误差较小，建模成功。

回归方程各项的方差分析表明，A、C、AC、A2 、B2 、C2 均达到差异极显著水平。回归方程中一次项系数绝对值的大小决定着各因素对响应值影响的主次顺序，可知3个因素对响应值影响的主次顺序为A（初始pH）>C（紫苏蛋白与木糖的质量比）>B（反应时间）。

2.3.2 响应面和等高线分析

通过Design-Expert 12.0软件对反应时间与初始pH值、蛋白和糖的质量比与初始pH值、蛋白和糖的质量比与反应时间之间的交互作用进行分析，结果见图6～图8。

由图6～图8可知响应值的变化趋势，曲面越陡，说明影响越显著：曲面越平缓，说明影响越不明显。二维等高线图可以进一步判断各变量间交互作用的强弱并确定最优点，等高线图越近似椭圆形，表明交互作用越强；等高线图越近似圆形，表明交互作用越弱。由图6～图8可知，在3组交互作用中，蛋白与糖的质量比与初始pH值的交互作用最强，反应时间与初始pH值、蛋白和糖的质量比与反应时间的交互作用不明显，这与表3中显著性检验结果完全符合。由響应面图可知，响应面的最高点为该模型在所选范围内的最佳值 。

经过回归模型的分析，使用响应面分析优化后获得紫苏蛋白美拉德反应产物的最佳工艺条件为pH 8.19、反应时间4.85 h、紫苏蛋白和木糖的质量比15∶1，预测DPPH自由基清除率达到54.18%。考虑实际操作，将初始pH调整为8.2，反应时间调整为4.8 h，在该条件下进行3 次实验，计算平均值为55.3%，与预测值54.18%接近，说明建立的模型可以较好地预测紫苏蛋白美拉德反应产物对DPPH自由基的清除能力，实测结果与预测值误差较小。

3 结论

在料液比1∶12、碱溶pH 9.0、50 ℃、溶解40 min、酸沉pH 4.4的条件下，提取紫苏蛋白纯度达69.9%。通过单因素实验得出，糖-紫苏蛋白美拉德反应产物的最适制备工艺为最适糖种类为木糖、紫苏蛋白于100 ℃加热4 h、紫苏蛋白与木糖最适质量比15∶1、起始pH 9.0。响应面优化结果显示各因素对抗氧化能力影响的主次顺序为初始pH值＞紫苏蛋白和木糖的质量比＞反应时间；考虑实际操作，将最佳工艺调整为初始pH 8.2、反应时间4.85 h、紫苏蛋白和木糖的质量比15∶1，此时对DPPH自由基的清除率达54.18% ，紫苏蛋白美拉德反应产物有较好的抗氧化活性，可为紫苏粕蛋白食品和天然蛋白抗氧化剂的研究和开发提供参考和依据。

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