丹参-莪术药对治疗癌性厌食的作用机制*

张甜，宋萌萌，贾文文，乔元勋

1 山东中医药大学 山东济南 250014

2 山东省泰安市中医医院 山东泰安 271000

癌性厌食（cancer-related anorexia，CA）是指与癌症或抗癌治疗相关的食欲减少甚至丧失，伴或不伴体重下降[1]。CA按照病因分为原发性和继发性两类。原发性厌食的具体临床机制尚不清晰。继发性厌食多由于抑郁、便秘、疼痛和接受抗肿瘤治疗等导致[2]。现代医学治疗，尚存在一定的不良反应[3-4]，而CA是癌症患者不容忽视的一大症状。

丹参性苦，微寒，归心、肝二经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的作用。莪术辛苦温，入肝、脾经，具有破血行气、消积止痛之功。大量临床研究表明丹参[5-7]、莪术[8-9]具有抗肿瘤的作用。同时丹参[10]、莪术[11-13]作为复方药物的组成之一，具有改善进食情况的作用，但机制尚不明确。本研究旨在通过网络药理学和分子对接预测丹参与莪术治疗CA的靶点，明确其作用机制，了解其作用原理，为进一步研究丹参—莪术治疗CA提供具体的理论依据。

资料与方法

1 药物成分获取

以“丹参、莪术”为关键词，检索中药系统药理学数据库（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），按照ADME参数设置化合物分子的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18进行筛选，获得丹参、莪术的化合物分子，结合文献[14-17]对莪术的化学成分进行补充。

2 药物基因靶点获取

通过TCMSP数据库对获得的丹参、莪术的化合物进行靶点蛋白获取，结合Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）获取对应的基因。文献中获取得到的莪术成分使用PharmMapper数据库（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），设定条件为物种Human Protein、Norm Fit>0.9，筛选得出对应靶点基因。

3 药物基因可视化分析

去重后利用cytoscape3.8.2软件实施网络可视化分析。

4 疾病基因靶点的获取

以“cancer-related anorexia”为关键词，分别在GeneCards数据库（https： //www.genecards.org/）和OMIM数据库（https： //omim.org/）中筛选，合并去重后得到CA相关的基因靶点。

5 疾病和药物交集基因获取

将疾病基因与药物交集基因输入“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/），获取韦恩图。

6 疾病—药物蛋白相互作用网络构建（PPI）及可视化分析

将疾病和药物交集基因导出到String数据库（https：//cn.string-db.org/），并设定物种为“Homo spanies”，将最低相互作用评分（minimum required interaction score）设置为medium confidence（0.400），并勾选隐藏游离的蛋白质。将结果导出到cytoscape3.8.2软件进行调整。

7 GO富集分析与KEGG富集通路分析

将潜在的基因靶点上传至Metascape数据库（https：//metascape.org/）中，选择物种为“H.sapiens”，进行custom analysis。分别得到GO富集分析及KEGG富集通路分析结果。KEGG富集通路分析按照P值进行升序排列；GO分析按logP值进行升序排列，结果利用“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。

8 核心活性成分-靶点分子对接分析

利用PDB数据库下载关键靶蛋白，从TCMSP数据库中下载核心活性成分的mol2结构，利用Autodock Tools进行去水、加氢、设置旋转键、盲对接等操作，再进行分子对接，最终结果通过pymol进行可视化处理。

结果

1 丹参、莪术化学成分的筛选结果

通过TCMSP数据库，经ADME筛选（OB≥30%，DL≥0.18）、文献补充、筛选后共得到丹参58个有效成分，莪术8个有效成分。见表1。

2 丹参、莪术化学物预测靶点

通过Uniprot数据库、PharmMaper数据库检索对应的基因，丹参58个化合物共有833个基因，莪术8个化合物共有90个基因，利用cytoscape3.8.2软件建立基因靶点与化合物的网络关系图，见图1。

图1 丹参—莪术基因靶点—化合物

3 疾病-药物交集基因

将丹参、莪术的基因靶点去重后得到丹参126个基因，莪术54个基因，并将疾病基因输入微生信网站得到交集基因，丹参-莪术交集基因为25个，CA与丹参-莪术的交集基因为14个。见图2。

图2 药物-疾病交集基因

4 蛋白互作图

基于String数据库分析“丹参-莪术”与CA靶点之间的交互作用，使用cytoscape3.8.2软件进行数据可视化分析，一个节点代表一个蛋白质，边则代表蛋白相互之间的作用关系，其中1个游离的蛋白质被舍弃，共13个点，22条边。利用Analyse network进行度的分析，度值越大则节点越大，颜色越红，表示“丹参-莪术”通过此靶点治疗CA的可能性越大。边按照combined score进行颜色、粗细调节，颜色越红，线条越粗，表示得分越高，蛋白互作关系越强。见图3、图4。

图3 string原图

图4 可视化后的PPI网络图

5 GO富集分析

GO分析中按logP值进行升序排列，结果显示生物过程（BP）有83个条目，细胞组分（CC）有4个条目，分子功能（MF）有18个条目。其中BP、MF展示前10个条目，CC展示全部条目。BP主要涉及细胞对有机环状化合物的反应、类固醇激素介导的信号通路、类固醇激素反应等；CC主要涉及膜小凹、膜微区、膜筏、质膜筏；MF主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、核类固醇受体活性、类固醇结合等。见图5。

图5 GO富集分析结果

6 KEGG富集通路分析

KEGG富集通路分析结果共得到20条信号通路，包括化学致癌-受体激活通路、癌症信号通路、雌激素信号通路、乳腺癌信号通路、催乳素信号通路、内分泌耐药的信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等，按照P值进行升序排列，并将该结果通过微生信网站进行可视化分析。见图6。

图6 KEGG富集通路分析结果

7 分子对接

通过cytoscape3.8.2软件进行degree筛选，将PPI得出的前2个核心靶点（MAPK1、ESR1）通过PDB数据库转换为受体（3SA0、1XPC），分别与前3个核心成分丹参新醌（dan-shexinkum d，MOL007093）、二氢丹参内酯（dihydrotanshinlactone，MOL007100）、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮（2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione，MOL007041）进行分子对接，对接次数设置为50次。通常认为当结合能＜-5kcal/mol时，靶点与药物成分结合较好，具体结合能见表2，其中MOL007100与3SA0、 MOL007093与1XPC、MOL007093与3SA0可见氢键连接。见图7-图9。

图7 MOL007100-3SA0

图8 MOL007093-1XPC

图9 MOL007093-3SA0

表2 分子对接结合能（kcal/mol）

讨论

CA具有发病率高的特点，是癌症患者常见的伴发症状。但其出现的机制尚不明了，影响因素较多。针对CA，现代医学可采用糖皮质激素、大麻素、醋酸甲地孕酮等药物[18]。而目前中医治疗上主要应用经方、验方、中成药注射剂及中医外治法[19]，但缺少指南统一标准。

本研究通过TCMSP数据库及相关文献补充，筛选得出丹参—莪术的活性成分，再由GeneCards、OMIM数据库中得到CA的疾病靶点，后利用String数据库进行蛋白互作分析，并通过cytoscape3.8.2软件进行可视化分析，筛选得到核心靶点，最终进行富集分析及分子对接。结果表明丹参新醌、二氢丹参内酯、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮与MAPK1、ESR1有较强的结合能力，在丹参、莪术治疗CA过程中具有重要作用。

MAPK是丝裂原活化蛋白激酶，也是CXC趋化因子的靶标之一[20]，趋化因子可结合相应受体，参与肿瘤形成、免疫反应等过程[21]，CXCL14作为趋化因子家族成员，参与了体重控制过程，并且可能在中枢神经系统调控摄食行为活动中起到重要作用[22]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由肠道L细胞所产生的激素，具有刺激胰岛素分泌、利尿、减少胃排空、减少炎症和细胞凋亡等作用[23]，研究表明GLP-1受体激活能够增加MAPK磷酸化达到抑制食物摄入的目的[24]。同时MAPK1是GATA3转录因子的转录靶标，去泛素化酶USP21可以通过与GATA3结合来调节MAPK1的表达[25]。当血管紧张素Ⅱ1型受体与血管紧张素Ⅱ结合后可激活细胞内MAPK途径以触发钠摄入[26]。另外，通过果蝇实验证明Dop1R2/Raf/MAPK通路是多巴胺信号在食欲嗅觉记忆稳定过程中的关键下游效应子[27]，能够以此来稳定食欲和嗅觉的记忆。

ESR1作为编码雌激素受体α（estrogen receptor，ERα）的基因，对于乳腺癌[28]、子宫内膜癌[29]、肝内胆管癌[30]等具有临床意义。ERα作为重要的雌激素受体之一，是调节正常摄食行为、维持正常的能量消耗和脂肪分布必不可少的[31]。ESR1能够调节SLC2A4基因的表达，改变组织胰岛素敏感型葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）含量，最终调节血糖[32]。也有研究表明ESR1与限制性神经性厌食有关，但相关的单核苷酸多态性还没有已知的功能，仍需要进一步实验[33]。

KEGG通路富集分析表明丹参、莪术治疗CA可能与雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等有关。雌激素信号通路有助于对抗肿瘤免疫的异常调节，还可能逆转出现免疫抑制的肿瘤微环境[34]。雌激素可以与GLP-1结合形成GLP-1-雌激素偶联物，其存在可以将雌激素特异性递送到表达胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的区域[35]，而SIM1神经元中的ERα可以部分介导GLP-1-雌激素偶联物，从而发挥减重作用[36]。此外，在已被切除卵巢的大鼠中进行实验，证实雌二醇（E2）具有抑制食物摄入的效力[37]。癌症患者的免疫系统会释放细胞因子，TNF-α作为其中之一，可通过血脑屏障，与大脑内皮细胞管腔表面相互作用，进而导致影响食欲下降的物质的释放[13]。在肿瘤恶病质患者中，血液TNF-α水平也出现显著增高，且与体重稳定组的肿瘤患者相比，肿瘤恶病质患者的皮下脂肪组织中TNF-αmRNA呈现高表达状态[38]。

综上所述，本研究针对丹参、莪术治疗CA的机制、作用靶点、通路进行预测，并运用分子对接进行验证，可知丹参、莪术的前3个核心成分为丹参新醌、二氢丹参内酯、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮并通过MAPK1、ESR1核心靶点入手，调节Estrogen signaling pathway、TNF signaling pathway等信号通路，达到改善患者食欲的目的。后续可继续进行实验验证，为进一步研究丹参、莪术治疗CA的临床效果，提供一定的指导意义。