先天性马蹄内翻足的遗传相关基因研究进展*

张旭升，周明旺，柳海平，高向明

（1.甘肃中医药大学 中医临床学院，甘肃 兰州 730000 ；2.甘肃省中医院 骨科，甘肃 兰州 730050）

先天性马蹄内翻足是小儿骨关节结构畸形中最常见的一种先天性足畸形，如果不及时治疗，将持续到成年期，导致行动不便和生活质量下降；其特征是后足内翻、前足内收、踝部马蹄和高弓足，较难矫正[1]，发病率为1‰～4‰，男女比例为2.5∶1.0，双侧较单侧多发[2]。目前，先天性马蹄内翻足的病因尚未明晰，但已知其涉及遗传因素，是一种多因素和复杂的疾病，与许多未知的遗传、社会人口和环境危险因素有关。研究表明，基因表达或突变可能在先天性马蹄内翻足的发生、发展中发挥重要作用，其家族史会增加个体出生时患该病的风险[3]。父母双方若均患有马蹄内翻足，则其子女患有马蹄内翻足的概率为10%～20%[4]。此外，遗传流行病学调查结果表明孕期吸烟是发生先天性马蹄内翻足的重要危险环境因素之一[5]。先天性马蹄内翻足的遗传性质并不遵循典型的孟德尔遗传模式[6]，所以由单个基因引起的可能性低，而是多基因和/或基于复杂遗传模式的多因素影响。因此，探究先天性马蹄内翻足的遗传基因对该病的临床预防及治疗有重大指导意义，本文就先天性马蹄内翻足的遗传相关基因研究进展作一综述。

1 遗传因素

遗传学在先天性马蹄内翻足的发展中起着至关重要的作用，研究表明24%～50%的患者有先天性马蹄内翻足家族史，且同卵双胞胎发生先天性马蹄内翻足的一致性为33%，异卵双胞胎则为3%[7]，说明遗传因素对该病具有显著影响。

先天性马蹄内翻足是一种多因素疾病且具有高度异质性和复杂性。相光华等[8]研究了67例先天性马蹄内翻足，发现有2例染色体异常，行羊水及脐带血穿刺检查，结果提示XYY及2p12位置发生缺失；CHEN等[9]采用队列、病例对照和随机试验分析总结了自1967年以来关于马蹄内翻足的42项研究，分析临床的危险因素，结果表明，母亲和父亲吸烟、母亲体质量指数＞30 kg/m2和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂药物可增加先天性马蹄内翻足的患病概率；另外，外界因素可影响胎儿足在子宫内的位置，导致位置性马蹄内翻足，如妊娠15周前羊膜穿刺术、羊膜带顺序、羊水过少或多胎妊娠[10]；ARMIN等[2]的研究指出，大多数在新生儿期确诊了先天性马蹄内翻足的患儿是臀位分娩，表明胎儿分娩时的体位也对马蹄内翻足有一定的影响。

先天性马蹄内翻足的发病机制主要是遗传因素和环境因素的共同作用，而其中遗传因素又占了很大一部分比重。最近的研究报告显示，先天性马蹄内翻足的发病机制与携带同源盒基因（homeobox gene, HOX）家族、胶原家族基因、T-box（TBX）家族基因、肌肉收缩基因的变化密切相关，不同的基因多态性可导致先天性马蹄内翻足的易感和不易感，而多个基因之间可能存在协同效应以及共同参与发病过程[11]，具体见表1。

表1 影响先天性马蹄内翻足的相关基因

2 HOX家族基因

HOX家族基因与肢体轴向骨骼和四肢的正常生长发育密切相关，因此HOX家族基因是先天性马蹄内翻足发病机制的主要候选基因。HOX家族基因是一组高度保守的转录因子，最初被发现于果蝇体内，在果蝇胚胎的前后轴发育中起着至关重要的作用，其缺失、突变或者异位表达均可以引起果蝇身体的同源异型转化[12]，进而影响正常的胚胎发育，最终导致肢体畸形。随着人们对HOX基因的深入研究，确定人类有39个HOX基因，分为HOXA、HOXB、HOXC、HOXD 4个簇。在HOX基因家族中，HOXA和HOXD在调节肢体形成中起重要作用，HOXB和HOXC的缺失不会诱发肢体异常[13]，因此，HOXA和HOXD在脊椎动物肢体发育中都起着不可或缺的作用，其缺失、变异会导致先天性畸形[14]，包括马蹄内翻足。

胎儿母亲与胎儿父亲的HOXA9基因表达模式存在显著差异，WANG等[15]从患先天性马蹄内翻足母亲的胎儿羊水细胞中获得了一个人的全基因组，同时胎儿父亲被临床诊断为双侧马蹄内翻足，并发现胎儿与父亲均存在rs3801776变异，表明HOXA9变异可能增加了先天性马蹄内翻足发生的概率，在病因学中起到重要的作用。WANG[16]通过蛋白质印迹分析发现，HOX在先天性马蹄内翻足患者的肌肉组织中表达升高，并且在先天性马蹄内翻足患者的肌肉组织样本中检测到HOXD10 mRNA表达水平的变化，表明HOXD10表达上调的突变可能会造成马蹄内翻足。

HOXD10表达的变化导致5'HOXC微缺失时出现下肢表型，说明5'HOXC微缺失的鉴定体现了转录调节因子在严重下肢畸形病因学中的重要性。HOXC缺失患者的肌肉体积一致减少，并且5'HOXC基因和上游调控区域的缺失会影响下游基因的表达水平，因此后肢转录调节因子可能是马蹄内翻足的重要影响因素[17]。LI等[18]研究表明，HOXA9基因在马蹄内翻足的发病机制中起到了重要作用，HOXA9基因的多态性位点rs3801776突变可增加先天性马蹄内翻足的患病风险。因此，可通过HOXA9基因启动子的相关位点遗传多态性分析对中国马蹄内翻足患儿进行筛查。

先天性马蹄内翻足模型大鼠中GLI3 mRNA和蛋白表达增加，这可能意味着HOXD13是GLI3的转录因子。HOXD13低表达可能导致肢体形成过程中GLI3表达升高，这可能在先天性马蹄内翻足发病机制中起关键作用[19]。HONG等[20]通过逆转录聚合酶链反应、实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测HOXD9 mRNA和蛋白表达，发现全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）使大鼠胚胎后肢芽间充质细胞（rat embryo hindlimb bud mesenchymal cell, rEHBMC）中HOXD9的表达降低。ATRA是现代实验胚胎学中最早显示出对肢体发育产生深远影响的分子之一，通过下调HOXD9的表达来抑制rEHBMC的软骨生成，这种效应可能通过下调HOXD9的表达来抑制软骨的生成参与胚胎肢体发育，从而导致先天性马蹄内翻足。综上所述，HOX家族中的HOXA9、HOXD10、HOXD9是先天性马蹄内翻足的易感基因，可以检测这些基因以期更加准确地了解先天性马蹄内翻足的发病机制。

3 胶原家族基因

胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，其家族由28个成员组成，至少包含一个三螺旋体域。许多疾病是由编码胶原α链的基因突变引起的，突变通过减少分泌胶原蛋白的数量来影响细胞外基质（extra cellular matrix, ECM），通过分泌突变胶原蛋白或诱导内质网应激和展开的超分子组装蛋白质反应，由于编码胶原蛋白的基因突变而致患先天性马蹄内翻足。其相关遗传学研究的焦点是COL9A1和COL1A2基因，近年来对COL1A1的研究也不断增多。Ⅰ型胶原是骨、韧带和肌腱等间质组织的主要组成成分，其由两条α1链及一条α2链组成，α1链由COL1A1基因负责编码，α2链由COL1A2基因编码[21]。COL9A1基因编码Ⅸ型胶原的α1链，Ⅸ型胶原是透明软骨中的主要成分[22]。

HUANG等[23]在一例患者中检测到纤维软骨标记基因COL1A1中c.3407 G＞C的突变，生物信息学软件预测这种错义突变会破坏蛋白质结构和功能，说明COL1A1的变异可能导致各种疾病的发生，包括先天性马蹄内翻足。WANG等[24]通过mRNA测序鉴定先天性马蹄内翻足患儿与正常患儿的差异表达基因，发现COL1A2基因上调，并通过蛋白质印迹和实时荧光定量聚合酶链反应检测发现COL1A2的表达增强，因此，COL1A2的高表达可能在先天性马蹄内翻足病理变化的调控中发挥潜在的重要作用。而COL9A1序列变异也可导致生长发育的异常，ZHAO等[25]确定了COL9A1 rs6455357与母亲饮酒之间的基因环境相互作用信号，COL9A1单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）的次要等位基因（A等位基因）与母亲饮酒的患者中先天性马蹄内翻足风险增加相关，结果表明COL9A1基因的遗传多态性和母亲饮酒与先天性马蹄内翻足的易感性。王正东等[26]采用免疫荧光染色及免疫组织化学染色发现，先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部组织中COL9A1蛋白表达高于对照组，证明先天性马蹄内翻足畸形的产生可能与COL9A1基因在足踝部组织的高表达有关。RAIKWAR等[27]分析了COL9A1基因在先天性马蹄内翻足患者及其母亲中的表达，发现位于COL9A1基因编码区的SNP位点rs1135056在G等位基因的频率高于对照组；与对照组相比，AA基因型频率降低，AG、GG基因型频率增高。因此，COL9A1基因高水平表达，rs1135056多态位点G等位基因与先天性马蹄内翻足的发生相关。

上述研究表明COL1A1基因的变异、COL1A2和COL9A1基因的高表达会增加先天性马蹄内翻足的致病概率。因此，建议今后应继续对先天性马蹄内翻足候选基因进行多态性分析，以发现新的先天性马蹄内翻足易感基因。

4 TBX基因

TBX家族包含在胚胎发生和形态发生中起关键作用的转录因子，其家族成员是具有高度保守的DNA结合结构域的转录因子，许多人类先天性发育综合征与突变的TBX基因有关[28]。TBX3和TBX4是脊椎动物肢体发育的重要调控基因，其作用与肢体的正常生长密切相关[29]；另外，遗传学研究发现PITX1变体与人类和小鼠的先天性马蹄内翻足表型有关，PITX1是后肢形态发生所必需的同源盒转录因子，PITX1缺失或错义变异会导致马蹄内翻足的发生[30]。

TBX3蛋白是TBX家族的一种转录抑制因子，在胚胎发育时期对四肢的发育起着重要作用，该基因的突变会影响肢体发育。任舒月等[31]通过在胚胎肢体发育调控相关基因Tbx3所在的染色体9p13、12q24区域内，选择2个微卫星DNA标记D9S319和D12S378，应用聚合酶链反应及放射自显影技术，证实先天性马蹄内翻足与D12S378遗传标记位点的第3个等位基因存在传递不平衡，提示TBX3是先天性马蹄内翻足易感基因。TBX4是TBX转录因子家族成员之一，在胚胎后肢中特异性表达。研究表明，过表达的TBX4野生型和突变体在细胞核中均有均匀表达，这表明这些突变不会改变TBX4向细胞核的易位，同时使用过表达TBX4的间充质干细胞进行了染色质免疫沉淀测定，结果表明TBX4突变体对FGF10启动子的异常生物过程，可引起下肢骨骼发育异常[32]；虽然没有直接的证据证明TBX4的变异与马蹄内翻相关，但TBX4作为后肢特异性表达的转录因子之一并且其变异可引起下肢发育异常，因此TBX4可作为下一步研究的一个目的基因，可通过全基因组关联分析以期证明TBX4与先天性马蹄内翻足的相关性。PITX1-TBX4通路负责早期肢体发育，研究表明，编码转录因子PITX1和TBX4的基因中的突变导致人类和小鼠的下肢肌肉组织和马蹄内翻足表型的减少[33-34]。PITX1是与肢体发育相关的转录因子，其缺失或变异可引起一系列下肢畸形。ROUCO等[35]通过结合单细胞转录组学和胚胎内细胞示踪方法，观察到PITX1低表达细胞的比例增加而高表达细胞的比例减少，并且PITX1低表达细胞的比例增加可导致马蹄内翻足表型。因此，先天性马蹄内翻足的发生可能与TBX3、TBX4和PITX1密切相关，今后应继续从这方面进行全基因组的分析，以期对马蹄内翻足的发病机制有更深的认识。

5 肌肉收缩基因

一些涉及远端关节弯曲症（distal arthrogryposis）病因学的肌肉挛缩基因被认为是马蹄内翻足的候选基因，包括TNNI2、TNNT3和TPM1[36]。TPM1是原肌球蛋白家族的成员，包括参与横纹肌和平滑肌收缩以及非肌肉细胞的细胞骨架的肌动蛋白结合蛋白。研究表明编码骨骼肌纤维收缩蛋白的基因在先天性马蹄内翻足中导致肌肉生长障碍而引起的肌肉失衡，先天性马蹄内翻足患者在出生时表现出临床上明显的小腿肌肉改变，通常在治疗后恢复[37]，这表明由于基因突变致异常纤维以迟缓的速度生长，无法跟上骨骼结构的生长，最终处于紧张状态，加之张力可能是产生马蹄内翻足的变形力。一些调节肌肉生长的生长因子减少，而抑制成肌细胞增殖和分化的肌肉生长抑制素存在于先天性马蹄内翻足患者的比目鱼-跟腱连接处，先天缺陷不均匀地影响腿部间的肌肉，可能导致肌肉失衡，进而导致胎儿发育过程中的马蹄内翻足畸形[38]。

肌钙蛋白（Troponin, Tn）是调节横纹肌收缩的关键蛋白复合物，由Tn-I、Tn-T和Tn-C 3个亚基组成，Tn-I抑制肌动球蛋白ATP酶，Tn-T结合原肌球蛋白和Tn-C[39]，Tn-C结合钙并克服肌钙蛋白复合物对肌动蛋白丝的抑制作用，从而限制肌肉收缩和足部运动，由于骨骼肌收缩功能障碍，当关节发生变形时，肢体将失去支持而逐渐发生下垂或屈曲畸形，进一步的受限可能会导致先天性马蹄内翻足。HUANG等[23]在研究中检测到TNNI2和TNNT3基因的突变，其中1例患者在连续2次怀孕的24孕周时通过超声观察发现胎儿足部的姿势异常，并通过脐带穿刺术进行了遗传学诊断，结果显示两次妊娠的胎儿都携带TNNI2基因的突变。另1例患者也表现出相同的表型，在第25周进行羊膜腔穿刺术时，发现TNNT3基因中新发变异。因此可认为编码骨骼肌纤维收缩蛋白的基因（TNNI2、TNNT3）变异在先天性马蹄内翻足的病因发生了一定的作用。LI等[40]对430例患有先天性马蹄内翻足的儿童和891例没有患先天性马蹄内翻足的儿童进行病例对照研究，探讨了3个TPM基因多态性（TPM1/rs4075583 G＞A、TPM2/rs2145925 C＞T和TPM2/rs2025126 G＞A）与先天性马蹄内翻足风险的潜在相关性，结果表明TPM1 rs4075583 G＞ A多态性与中国南方人群的先天性马蹄内翻足风险相关。这可能是由于先天性马蹄内翻足患儿可能存在TPM1多态性异常表达，进而导致先天性马蹄内翻足的发生。

综上所述，影响肌肉发育的TNNI2、TNNT3和TPM1基因变异可能是先天性马蹄内翻足发病的危险因素之一，因此可认为编码骨骼肌纤维收缩蛋白的基因变异为先天性马蹄内翻足的发病机制提供了有力的证据。

6 其他基因/因素

N-乙酰转移酶（N-acetyltransferase, NAT）基因的多态性可以使香烟中的自由基乙酰化活性降低，而先天性马蹄内翻足与吸烟引起的DNA氧化损伤有关，这表明芳香胺的生物转化和DNA加合物的积累不足，导致潜在的毒性作用和先天性马蹄内翻足的发展。因此NAT被认为是导致先天性马蹄内翻足发病的候选基因[5]。PANDEY等[41]通过聚合酶链反应和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetra hydro folate reductase, MTHFR）基因进行了SNP分析，发现MTHFR基因变异增加了先天性马蹄内翻足发生的概率，变异位点为C677T，同时发现该基因参与调节细胞周期中的细胞分裂和生物合成，因此可认为该基因变异可能与先天性马蹄内翻足发生相关。徐晨晨等[42]通过构建先天性马蹄内翻足样品的基因表达谱，发现分泌磷酸蛋白1（secreted phosphoprotein 1, SPP1）和核糖体蛋白S27（ribosomal protein S27, RPS27）在试验组和对照组中基因相对表达量差异明显，表明SPP1和RPS27可能与先天性马蹄内翻足的发病相关。SPP1的高表达可增加先天性马蹄内翻足的发病概率[43]，而SPP1编码骨桥蛋白的蛋白质，骨桥蛋白是位于骨内的非胶原细胞外凝集糖蛋白之一，可以调节人脐静脉内皮细胞的增殖、运动、迁移和血管形成，然后可能导致先天性马蹄内翻足的发生。张真翊等[44]研究发现，实验组足踝部组织低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）表达下调，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、跨膜受体蛋白（Notch-1）的表达减少，推测HIF-VEGFNotch信号通路可能与马蹄内翻足畸形的发生相关。李汾杰等[45]研究发现先天性马蹄内翻足大鼠的足踝部组织中Sox9高表达受Wnt/β-catenin信号通路调控，而且该通路参与先天性马蹄内翻足畸形的形成。因此NAT、MTHFR、SPP1基因的变异或者高表达可引起先天性马蹄内翻足的发生，另外HIFVEGF-Notch信号通路与Wnt/β-catenin信号通路也参与先天性马蹄内翻足畸形足的形成。

7 总结与展望

综上所述，先天性马蹄内翻足在遗传和基因方面的病因是十分复杂的，其遗传因素与环境因素密切相关，随着基因组学、蛋白质组学和其他组学技术的应用，马蹄内翻足的遗传学机制正在逐步得到证实，在人类和动物中已经发现了多种相关易感基因，包括HOX家族基因（HOXA、HOXD）、胶原家族基因（COL1A1、COL9A1）、TBX基因（TBX3、TBX4、PITX1）等，还有由影响肌肉收缩的基因（TNNI2、TNNT3、TPM1）的突变和NAT、MTHFR、SPP1基因的变异引起的肢体缺陷，此外HIF-VEGF-Notch与Wnt/β-catenin信号通路也与先天性马蹄内翻足病因有关。这些易感基因与相关的危险因素在不同体质的人群中表现出不同的致病机制，但由于先天性马蹄内翻足发病机制复杂，临床表现多种多样，给该病诊断及治疗带来一定的困难。总之，由于先天性马蹄内翻足畸形足是一种复杂的畸形，其发病机制复杂，涉及到多个易感基因，因此，研究先天性马蹄内翻足畸形足的发病机制对预防其发生及治疗有重要意义。今后在遗传基因方面应继续加深研究，应用全基因组学技术以及不断进步的科技手段，以期更加明确先天性马蹄内翻足的易感基因与生物分子遗传学机制，为揭示病因、预防和治疗疾病提供理论依据。