细胞衰老与特发性肺纤维化相关机制的研究进展*

谈华栋,刘明远,伍 旭,詹 峰 综述,倪吉祥 审校

(三峡大学第一临床医学院/宜昌市中心人民医院西陵院区呼吸与危重症医学科,湖北 宜昌 443003)

特发性肺纤维化(IPF)是一种随着年龄增长逐渐加重,主要表现为活动性呼吸困难,进行性加重,且不可逆的疾病。随着对IPF临床表现的认识不断提高,高分辨率CT(HRCT)的广泛使用及其他潜在因素导致IPF的患病率在过去20年中不断上升,特别是在65岁以上的人群中[1],显然IPF的发病率与衰老存在某种联系。且IPF目前无法完全治愈,除了肺移植外,抗纤维化治疗也只能部分阻止纤维化的进程[2]。衰老是一个以多种复杂因素相互作用为特征的过程,例如生理异常、危险因素的负面影响积累、异常细胞群和组织,从而导致整个生物体的进行性功能损害,也是IPF最重要的危险因素,其病理生理学特征包括端粒损耗、DNA损伤、蛋白质发育异常、线粒体功能障碍、氧化应激、自噬失调和内质网(ER)应激等[3]。在细胞水平上,衰老和IPF的病理学存在大量重叠,表现为细胞衰老标志物的表达增加。衰老的特征是细胞生长停滞和复制潜力降低,通过损害肺泡祖细胞的再生和促进促纤维化细胞环境,使肺易发生纤维化。在IPF中,肺泡2型上皮细胞表现出衰老标志物优先定位于成纤维细胞病灶的异常上皮细胞表达,特别是高水平的衰老蛋白转录产物[4]。本文主要对IPF细胞衰老相关发病机制及治疗进展进行综述。

1 端粒功能障碍

端粒是线性染色体末端的基因组部分。脊椎动物的端粒DNA是由TTAGGG重复序列和一组蛋白质组成的,这些蛋白质调节其生物功能,保护它们不被识别为DNA损伤,并且防止触发DNA损伤反应(DDR)。在没有端粒酶的情况下,标准的DNA聚合酶不能完全复制线性DNA模板,而且由于核酸裂解过程,DNA复制导致染色体端粒逐渐缩短。当端粒达到临界长度时,其无法结合足够的端粒封顶蛋白,并被感知为暴露的DNA末端,这就激活了DDR途径[5]。然而,这种短端粒保留了足够数量的端粒结合蛋白,以抑制DNA修复和避免融合,从而引发持续的DNA损伤信号,导致DNA损伤所诱导的永久性增殖停滞。进而启动并维持细胞衰老,这是有机体衰老和多种年龄相关疾病的关键因素[6]。有研究表明,端粒功能障碍是可以概括IPF特征的,且已有研究在IPF中确定了几个端粒相关基因的基因突变[7]。此外,在小鼠肺泡2型上皮细胞中,端粒的损伤促进了纤维化和衰老上皮细胞的积累[8]。一项meta分析认为,更长的端粒和降低间质性肺疾病(ILD)风险的关系从可能的证据升级为强有力的证据,即端粒长度的延长与IPF风险呈负相关[9]。同样一篇关于端粒长度与健康相关结局的孟德尔随机化研究分析指出,白细胞端粒长度延长与IPF风险降存在关联。线粒体功能障碍和线粒体活性氧(mtROS)的产生会导致DNA损伤和无效修复,其中至少部分原因是由于端粒维持功能障碍[10]。持续的DNA损伤被激活而导致衰老的一系列反应,其中包括共济失调-毛细血管扩张突变/核因子-κB(NF-κB)必需修饰剂(ATM/NEMO)、p53、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号传导。NF-κB也是通过p21等分子引起这种反应的重要介质,这些分子可能促进细胞衰老[11]。此外,NF-κB在IPF肺中的表达增加,其在肺泡上皮细胞中的特异性表达对于衰老是必需的[12]。最近的研究发现,PI3K/AKT失调与下游NF-κB活化之间存在机制关联,导致促纤维化基因表达,其可能存在于成纤维细胞和上皮细胞中[13]。

2 细胞衰老表型

IPF的特点是存在抗凋亡和抗衰老的成纤维细胞,产生过度坚硬的细胞外基质(ECM)。ECM影响了细胞功能和组织稳态,异常的ECM与肺纤维化的发生密切相关。而衰老会逐渐改变ECM成分,并与衰老细胞的积累有关。衰老细胞通过表达与衰老相关分泌表型(SASP)相关的因子来促进与年龄相关的组织功能障碍,例如转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶(MMP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等[14]。SASP具有强大的自分泌和旁分泌作用,并通过一些生物过程来调节组织微环境,如细胞增殖、迁移、炎症、纤维化、ECM降解、新生血管形成、组织修复和再生、衰老清除和上皮-间质转化(EMT)。另外,无论是NF-κB还是上述端粒功能障碍中提到的其他途径,SASP特征都是炎症蛋白的分泌。最近有研究表明,许多烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)代谢酶,包括烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)、Sirtuins、ADP-核糖PARPs和 CD38,在ECM重塑和纤维化中起关键作用[15]。另外,NAD稳态也影响着IPF中衰老细胞的发育和功能,一方面,低NAD诱导的DNA损伤和线粒体功能障碍的积累可以促进衰老的发展;另一方面,细胞衰老的发展及其分泌表型似乎对代谢要求很高,衰老过程中发生的低NAD状态可能会抑制细胞衰老的发展[16]。例如研究发现在IPF的衰老成纤维细胞中,线粒体的功能障碍降低了NAD+/NADH比值,而NAD+代谢控制着促炎SASP的产生[17]。另外有研究发现,衰老细胞分泌的TGF-β会导致邻近的细胞衰老,因为TGF-β上调了细胞周期抑制剂p21、p27和p15,进而通过SMAD信号通路以旁分泌方式诱导邻近细胞衰老,这可能对器官衰老很重要,尤其是在缓慢自我更新的组织(如肺)中,因为肺泡2型上皮细胞衰老可能会扩散到同一器官内的其他细胞[18]。老化的肺泡2型上皮细胞通过表达血小板源性生长因子(PDGF)、TNF、内皮素-1、结缔组织生长因子(CTGF)、趋化因子CXC配体12(CXCL12)和PAI-1等SASP,来诱导成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增殖和活化。其中一个显著成分是PAI-1,其在肺泡2型上皮细胞中高度表达。PAI-1的过度表达促进ECM的积累,并作为细胞衰老的强诱导剂,特别是在肺泡2型上皮细胞中。TGF-β1通过多种信号通路增加PAI-1的表达[19],如TGF-β1诱导肺泡2型上皮细胞衰老,其衰老作用是由PAI-1介导的,TGF-β1通过激活素受体样激酶5和Smad3磷酸化诱导肺泡巨噬细胞产生PAI-1[20]。此外,CTGF通过介导活性氧(ROS)积累诱导成纤维细胞衰老,导致p53的激活和p16INK4a的诱导。尽管SASP的分泌受与p53和Rb途径相关的细胞周期停滞的调节,但抑制p53或Rb途径不足以阻止SASP诱导的作用。虽然SASP的分泌可能发生在衰老成纤维细胞和肺泡上皮细胞中,但只有肺泡上皮细胞分泌的SASP似乎对纤维化的进展很重要。靶向细胞衰老可能是一种有前途的治疗途径,因为动物模型中的几项研究表明,在给予senolytics(一种特异性靶向衰老细胞的药物)后纤维化会减弱[21]。有研究报道,重组胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)的鼻内递送可保护老年小鼠免于体重减轻,并在博来霉素肺损伤后显示出抗纤维化作用。IGFBP2转基因小鼠揭示了2型肺泡上皮细胞中的衰老和SASP因子减少,并且其改善了博来霉素诱导的肺纤维化[22]。与过敏性肺炎和(或)慢性阻塞性肺疾病患者相比,从IPF和(或)肺动脉高压患者的纤维化肺区域分离的肺泡上皮2型细胞中IGFBP2表达受到显著抑制。

3 线粒体稳态

线粒体稳态与细胞衰老的调节密切相关,其作为重要的细胞器,在细胞能量产生和代谢稳态中起着关键作用。在IPF的发病机制中,线粒体功能障碍主要涉及线粒体ROS水平失衡、线粒体DNA的改变、线粒体介导的自噬减少和电子传递链失衡。有研究表明,线粒体功能障碍所参与的IPF组织细胞的凋亡与衰老,被认为是衰老时易发生纤维化的重要标志。线粒体生成的ROS增加可诱导肺纤维化,ROS可以激活TGF-β,TGF-β也可以反过来激活ROS,如此形成恶性循环[23]。氧化酶4(NOX4)被认为是线粒体功能障碍的中介[24]。NOX4酶与线粒体相互作用,影响线粒体功能及线粒体ROS和SIRT的产生,共同促进上皮损伤和肺纤维化[25]。由于线粒体膜上的磷脂对反应性物质的敏感性,长期暴露于ROS可导致线粒体氧化损伤,并可进一步诱导更多的ROS产生。NOX4还通过控制Smad2/3和调节PDGF诱导成纤维细胞迁移来调节α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原蛋白的含量[26]。此外,线粒体功能障碍的积累还导致了NADH氧化为NAD的减少,并降低NAD/NADH比值,进而激活AMPK和p53,导致衰老表型[27]。在香烟烟雾诱导的肺纤维化小鼠模型中,香烟烟雾通过增加线粒体ROS和减少自噬和线粒体自噬来诱导2型肺泡上皮细胞衰老[28]。最近还有研究表明,线粒体质量维持机制(如线粒体生物发生和线粒体自噬)的破坏也可能使2型肺泡上皮细胞易衰老。由于表面活性剂产生的高代谢需求,2型肺泡上皮细胞特别容易受到线粒体功能障碍的影响。在IPF患者的2型肺泡上皮细胞中观察到异常增大和肿胀的线粒体[29]。

参与衰老和线粒体功能的特定蛋白质在IPF中失调。例如,磷酸酯酶与张力蛋白同系物(PTEN)诱导的激酶-1(PINK1)通常促进线粒体自噬并稳定线粒体膜完整性。一些研究强调了PINK1在纤维化中的重要性,因为PINK1缺陷小鼠更容易发生纤维化[30]。PINK1还提供了ER应激和线粒体功能障碍之间的机制联系。ER应激通过激活转录因子3(ATF3)下调PINK3,并通过ATF4导致线粒体未折叠蛋白反应(UPR)的类似程序发生[31]。与PINK1缺乏相关的线粒体功能障碍则通过释放线粒体DNA(mtDNA)导致纤维化,mtDNA激活Toll样受体(TLR)并刺激TGF-β[32]。

与衰老相关的端粒功能障碍还可通过p53介导的过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)共激活因子-1α(PGC-1α)和PGC-1β的下调抑制了线粒体生物发生途径,导致线粒体质量进一步受损及mtROS产生增加[33]。端粒相关DNA损伤可诱导雷帕霉素(mTOR)的机制靶标,并通过增加mtROS产生促进上皮衰老。因此,mTOR在几种慢性肺部疾病中上调,包括IPF[34]。因此,IPF中线粒体功能障碍具有重要地位,同时也有待进一步研究。

4 自 噬

在纤维化模型中观察到的自噬受损,可能代表IPF的致病性特征。自噬为一种细胞稳态程序,其通过隔离在双膜结合的自噬体中和随后的溶酶体依赖性降解来控制长寿命蛋白质和功能失调的细胞器(即线粒体)的周转。诱导自噬是抗衰老途径的标志,在细胞应激期间充当促生存机制,包括ER应激、缺氧和氧化应激。越来越多的研究表明,mTOR介导的通路可能在促进IPF方面发挥不可或缺的作用。mTOR是一种丝氨酸-苏氨酸激酶,具有mTORC1和mTORC2 2种复合物形式。mTORC1主要在不利环境中调节细胞生长和自噬,从而改变成纤维细胞的增殖和活力;mTORC2主要作用于细胞骨架蛋白构建和细胞存活[35]。TGF-β可通过激活自噬抑制剂mTOR复合物1(mTORC1)抑制自噬,而mTORC1在衰老细胞和IPF细胞中的持续激活,导致了自噬减少[36]。有新的研究发现,tetrandrine恢复了TGF-β1诱导的受损自噬通量,并伴SQSTM1和MAP1LC3-Ⅱ相互作用增强,同时tetrandrine通过增加NRF2和SQSTM1启动子的结合来诱导自噬。此外,tetrandrine通过减少Rheb的激活来抑制TGF-β1诱导的mTOR磷酸化[37]。因此,在未来,tetrandrine可能会给IPF提供一种新的治疗方式。自噬受损在IPF发病机制中的功能意义尚不清楚,但可能与线粒体质量控制受损、脂质和胶原蛋白周转受损及病原体清除受损等因素有关。有研究发现,表面活性蛋白C突变导致自噬晚期阻滞和p62在2型肺泡上皮细胞中的积累[38]。p62的积累可能与纤维化相关的异常下游信号传导有关,包括NF-κB调节和NRF2调节。有研究评估了泛素特异性蛋白酶13(USP13)在年龄相关性肺纤维化中的作用,并证明了USP13缺陷的老年小鼠表现出自噬活性受损,并且对博来霉素诱导的纤维化增加了脆弱性。在机制上,USP13与Beclin1相互作用并去泛素化,Beclin1过表达消除了USP13破坏的影响。此外,Beclin1抑制导致了博来霉素损伤后自噬不足和更严重的肺纤维化,并且与老年USP13缺陷小鼠的表型一致。另外,在甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)基因内含子中编码的microRNA-33家族是甾醇和脂肪酸代谢的主要调节因子,microRNA-33控制巨噬细胞免疫代谢反应并增强线粒体生物发生、脂肪酸氧化和胆固醇外排。巨噬细胞中microRNA-33的缺失可改善线粒体内稳态并增加自噬,同时减少博来霉素损伤后的炎症反应。并且通过施用抗microRNA-33肽核酸(PNA-33)对巨噬细胞中microRNA-33的药理学抑制可减轻不同体内和离体小鼠肺纤维化模型的纤维化[39],此发现也为IPF提供了潜在的新治疗方法。

5 ER应激

在IPF中,ER应激和UPR已被确定为纤维化的上游介质,且ER应激和UPR的标志物在IPF肺的2型肺泡上皮细胞中升高[40]。2型肺泡上皮细胞对蛋白质稳态特别敏感,因为其会产生大量表面活性剂蛋白质。ER应激的标志物出现在IPF患者的无症状亲属和IPF肺的组织学正常区域,表明ER应激在疾病的发展中很重要[41]。在纤维化肺中观察到ER应激期间ER蛋白折叠伴侣(例如FK506结合蛋白13)的表达增加,并且与较差的肺功能相关[42]。ER相关降解(ERAD)可防止ER中错误折叠蛋白的积累,但该过程的生理调节仍不明确。但有研究发现,一种抗病毒RNA干扰途径,称为ER相关RNA沉默(ERAS),其与ERAD一起作用以保持ER稳态和功能。在ER应激的诱导下,ERAS由精氨酸蛋白RDE-1/AGO2介导,在哺乳动物中促进ER相关RNA周转[43]。

ER应激中的UPR信号通路首先在酵母中发现,其中ER应激仅由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/内切核糖核酸酶肌醇需要的酶1(IRE1)控制。这与脊椎动物形成鲜明对比,脊椎动物主要由3个信号调节UPR:IRE1、ATF-6β和蛋白激酶R样ER激酶(PERK)。这些途径将ER中蛋白质折叠状态的信息传递到细胞质和细胞核,以恢复蛋白质折叠能力。ER伴侣结合免疫球蛋白(BiP)(也称为GRP-78)与IRE1α结合导致其失活[44]。在ER作用下,BiP优先与错误折叠的蛋白质结合,随后从PERK和IRE1中释放出来,从而启动这些蛋白质的二聚化。近期一项研究在肺泡上皮2型细胞中特异性地诱导敲除ER伴侣GRP78,其丢失导致了ER应激/未折叠的蛋白质反应、细胞凋亡、衰老和肺泡上皮2型细胞的祖细胞能力受损,以及年龄相关的肺纤维化[45]。GRP78敲除小鼠发展成具有IPF几个特征的肺纤维化,包括老年小鼠的敏感性增加。GRP78敲除和IPF肺的纤维化在ER应激抑制剂TUDCA的离体培养中得到改善。此外,GRP78在老年小鼠和IPF患者的AT2细胞中减少,表明GRP78减少是将衰老与IPF联系起来的潜在机制[45]。

6 小 结

随着新技术的进步,人们对细胞衰老与IPF之间有了更透彻地了解,病因的确定可以建议治疗方案,包括试图抵消端粒缩短或抵消tDDR活化、使用特异性靶向细胞衰老药物、抑制相关炎症反应、调节线粒体及ER的功能稳定等。但是或许有其他因素参与其中还未被发现,所以对于IPF疾病的发生发展仍需更深入的研究。