姜黄素联合富硒酵母对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

梁婵华?莫丽?田重阳?唐玉涵

摘 要：目的：探讨姜黄素联合富硒酵母对急性酒精性肝损伤的保护作用。方法：将60只C57B6L/J小鼠随机分为空白组、模型组、姜黄素组（33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母组（7.50 mg·kg-1 bw）和联合组（姜黄素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw），每组12只；干预30 d后，一次性灌胃50%乙醇溶液（12 mL·kg-1 bw）建立急性酒精性肝损伤模型；观察小鼠体重、摄食、行为变化；检测小鼠肝脏指数与丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平；油红染色观察小鼠肝脏组织病理学变化。结果：与空白组比较，模型组小鼠表现出肝脏肿大、肝细胞中脂滴大量堆积病理损伤，肝脏组织MDA和TG水平显著升高（P＜0.05）；姜黄素联合富硒酵母能显著降低小鼠肝脏中MDA和TG表达，提高GSH水平（P＜0.05），减轻小鼠肝脏脂肪沉积。结论：姜黄素联合富硒酵母能够改善急性酒精灌胃诱导的肝脏脂质异常堆积，减轻氧化应激水平，对急性酒精性肝损伤具有良好的保护作用。

关键词：姜黄素；富硒酵母；急性酒精性肝损伤

Protective Effect of Curcumin and Selenium-Rich Yeast on Acute Alcoholic Hepatic Injury in Mice

Abstract： Objective： Exploring the protective effect of curcumin combined with selenium-rich yeast on acute alcoholic liver injury. Method： 60 C57B6L/J mice were randomly divided into blank group， model group， curcumin group （33.33 mg·kg-1 bw）， selenium-rich yeast group （7.50 mg·kg-1 bw） and combination group （curcumin 33.33 mg·kg-1 bw+selenium-rich yeast 7.50 mg·kg-1 bw）， 12 mice in each group; 30 days after the intervention， a model of acute alcoholic liver injury was established by one-time gavage 50% ethanol solution （12 mL·kg-1 bw）; the weight， feeding and behavior changes of mice were observed; liver index and the levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and triglyceride （TG） were detected， and the histopathological changes of the liver were observed by oil red staining. Result： Compared to control group， the model mice showed liver enlargement， massive accumulation of lipid droplets in liver cells， and significantly increased MDA and TG levels （P＜0.05） in liver tissues， while curcumin combined with selenium-rich yeast could significantly reduce the expression of MDA and TG in the liver， increase the level of GSH （P＜0.05）， and reduce the fat deposition in the liver. Conclusion： Curcumin combined with selenium-rich yeast can improve abnormal accumulation of liver lipids induced by acute alcohol gavage， reduce the level of oxidative stress， and have a good protective effect against acute alcoholic liver injury.

Keywords： curcumin; selenium-rich yeast; acute alcoholic liver injury

酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）是由于長期大量摄入酒精引起的一系列肝脏疾病，包括以甘油三酯积聚为特征的酒精性脂肪肝，以肝细胞损伤、气球样变、炎症为主要病理改变的酒精性慢性肝炎，最终发展为肝硬化和肝细胞癌[1]。随着居民消费水平的不断提高，酒精的消费量不断增加，世界卫生组织报告，全世界每年有300万人因过度摄入酒精而死亡，有害使用酒精分别占全球男性和女性疾病负担的7.1%和2.2%[2]。目前，酒精性肝损伤的治疗方法主要为营养支持和对症治疗，但长期用药会带来不良副作用。因此，需要探寻有效预防和治疗酒精诱导肝损伤的方法。

姜黄素（Curcumin）是一种从姜黄根茎中提取，具有二酮结构的天然多酚化合物[3]。近年来研究发现，姜黄素具有抗氧化、抗炎、免疫调节、降血糖、保护急性酒精性肝损伤[4]和改善非酒精性脂肪肝病等生物学和药理学作用[3]。硒（Selenium，Se）是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶或硫氧蛋白还原酶等多种酶的辅因子。与无机硒相比，硒蛋氨酸和硒半胱氨酸等有机硒在人体中生物利用率更高[5]。富硒酵母则是利用酵母将无机硒转化为利用率更高的有机硒[6]。此外，研究结果表明，富硒酵母具有抗癌[7]、保护慢性肝损伤[8]、改善脂质代谢紊乱[9]和促进骨骼健康[10]等生理作用。但姜黄素与富硒酵母对酒精性肝病的保护作用报道较少。程金来等[11]发现一次性大剂量酒精灌胃会造成小鼠急性酒精性肝损伤，因此，本文根据《保健食品检验与评价技术规范》（2022版）建立小鼠模型，通过观察姜黄素联合富硒酵母对急性酒精灌胃诱导肝损伤小鼠脂质沉积及氧化应激的影响效果，探讨其保护肝脏的作用，为研发安全有效的护肝产品提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒酵母（批号：20211231026）、姜黄提取物（姜黄素含量95%，批号：J220224），安琪酵母股份有限公司；甘油三酯（Triglyceride，TG）测定试剂盒（货号：A110-1-1）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（货号：A003-1-2），南京建成生物有限公司；还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione Disulfide，GSSG）检测试剂盒（货号：S0053）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0010），碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

电子天平，Sartorious公司；多功能酶标仪，BioTek公司；5810R低温高速离心机，Eppendorf公司；荧光倒置显微镜，OLYMPUS公司；涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂；恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；恒温培养箱，SANYO 公司；KZ-III研磨仪经济型，天津赛维尔公司。

1.3 实验动物

60只SPF级C57BL/6J雄性成年小鼠，体重18～20 g（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号为SCXK<湘>2019-0004），于华中科技大学同济医学院农药毒理研究中心饲养（实验动物设施许可证号：SYXK（鄂）2019-0046）。环境温度（24±1）℃，相对湿度55%～75%。

1.4 实验方法

1.4.1 动物实验分组

所有小鼠经适应性饲养1周后，依照体重随机分为5组（12只/组）：空白组对照组、模型对照组、姜黄素组（姜黄素33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母组（富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）、联合组（姜黄素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）。

1.4.2 动物实验饲养

实验小鼠每日经口灌胃给予姜黄素、富硒酵母和姜黄素与富硒酵母混合溶液，空白组和模型组灌胃蒸馏水，连续灌胃30 d。小鼠均采用标准饲养环境，自由摄食饮水。每天观察动物摄食、饮水、活动和一般情况，每周称重2次，按照体重调整受试样品的灌胃剂量。小鼠急性酒精性肝損伤模型于实验第30 d进行，除空白对照组外，其余小鼠给予50%分析纯乙醇（无水乙醇与蒸馏水为1∶1稀释）一次性灌胃，灌胃量为12 mL·kg-1 bw，空白对照组给予等量蒸馏水。禁食不禁水16 h后处死动物，取材进行各项生化检测及病理组织学检查。

1.4.3 肝脏生化指标检测

取100 mg肝组织，加入900 μL PBS，振动研磨，充分研磨后，以10 000×g离心10 min，取上清，通过生化试剂盒测定MDA、TG及GSH的含量。

1.4.4 肝脏组织病理学观察

肝脏油红O染色观察小鼠肝脏脂肪沉积，取部分经固定、脱水的肝脏组织于包埋机进行包埋，制备冰冻切片，进行油红染色，并将染色片置于光学显微镜下观察肝脏组织中脂滴的数量与分布面积。对肝脏组织染色情况进行脂质沉积评分，细则如下。①肝细胞内脂滴数量稀少、散在分布，则计0分；②肝脏组织中含有脂滴的肝细胞数量不超过肝脏组织面积的1/4则计1分；③不超过肝脏组织面积的1/2则计2分；④不超过肝脏组织面积的3/4则计3分；⑤整个肝脏组织几乎充满脂滴则计4分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 姜黄素联合富硒酵母对急性酒精性肝损伤小鼠体重和脏器的影响

由表1可知，各组小鼠的初始体重均无显著差异（P＞0.05）。实验期间小鼠进食、饮水、活动正常，小鼠体重均有所增长，但各组小鼠最终体重差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏指数（肝体比）显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，联合组小鼠肝脏指数降低3.6%，但差异无统计学意义。

2.2 姜黄素联合富硒酵母对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏氧化应激的影响

由图1可知，一次性大剂量酒精灌胃导致肝脏氧化应激的发生，模型组小鼠肝脏的MDA水平显著高于空白组（P＜0.05）。与模型组相比，姜黄素组、富硒酵母组、联合组小鼠肝脏中MDA水平分别显著降低了26.5%、35.3%和30.9%（P＜0.05）。相比于空白组，模型组小鼠肝脏组织中GSH水平有所上升，但无统计学差异。富硒酵母组、姜黄素组和联合组小鼠肝脏的GSH水平较模型组均显著升高（P＜0.05），其中联合组升高了25.1%。

2.3 姜黄素联合富硒酵母对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏TG水平的影响

由图2可知，急性酒精性肝损伤模型组小鼠肝脏TG水平较空白组显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，联合组小鼠肝脏中TG水平显著降低了30.6%（P＜0.05）。

2.4 姜黄素联合富硒酵母对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂质沉积的影响

观察油红O染色结果发现，空白组小鼠肝细胞中散在少量、小体积、分布均匀的小脂滴。然而，模型组小鼠可以看到肝细胞内充满大量弥漫性、大小不一的橘红色脂滴，且比空白组体积增大，数量增多。相比于模型组，姜黄素组、富硒酵母组及联合组小鼠肝细胞内脂滴数量减少，体积减小，其中姜黄素与富硒酵母联合干预对急性酒精诱导小鼠肝脏脂质沉积改善效果最佳，见图3。每组取5只小鼠进行病理评分，对各组小鼠肝脏组织脂质沉积情况进行评分，结果如表2所示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏病理得分增加，脂肪面积占比显著升高（P＜0.05）。各组小鼠肝脏病理得分较模型组均有所下降，姜黄素组、富硒酵母组和联合组脂肪面积占比较模型组显著降低了50.6%、39.7%和52.9%（P＜0.05）。

3 结论与讨论

大量饮酒能够增加超重、肥胖、非酒精性脂肪肝相关肝硬化的肝癌风险，已成为疾病、残疾和死亡的重要因素[12]。本實验按照《保健食品检验与评价技术规范（2022版）》要求，姜黄素、富硒酵母单一及联合干预30 d后一次性急性灌胃50%乙醇溶液，观察到单一药物和联合药物对检测指标有不同程度的改善效果，其中姜黄素联合富硒酵母干预对小鼠肝损伤的改善效果最佳。

肝脏是乙醇毒性的主要靶器官，乙醇能在肝细胞中反应代谢产生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和具有肝毒性的乙醛，乙醛能与DNA和蛋白质反应，从而形成诱导肝细胞损伤的加合物[13]。酒精性肝病的发病机制涉及脂肪堆积、炎症、氧化应激和肝星状细胞刺激的纤维化等病理进程。氧化应激是有害物质刺激机体时，抗氧化系统清除氧化物能力远远低于ROS产生程度，导致氧化系统与抗氧化防御系统平衡紊乱[14]。当ROS过量时，内源性ROS清除剂能够中和部分自由基，但抗氧化剂被耗尽后，细胞膜与ROS结合，促进MDA等脂质过氧化物产生，导致细胞脂质、蛋白质和DNA等大分子损伤[15]。因此，MDA水平与氧化应激程度密切相关，MDA水平越高，则表明机体氧化损伤程度越严重。叶敏贞等[16]研究表明，小鼠急性酒精灌胃后，肝脏组织中MDA水平显著升高，同时抗氧化剂水平显著降低，提示机体处于氧化系统与抗氧化系统失衡的氧化应激状态，从而促进小鼠急性肝损伤的发生发展。还原型谷胱甘肽是一种非酶抗氧化剂，其主要活性基团巯基可以与ROS自由基结合，从而降低氧化水平和炎症损伤[17]。然而，研究发现有害物质刺激动物在短时间内肝脏、肾脏、睾丸等组织会出现GSH应激性升高[18-19]。杨柳等[20]研究结果也表明小鼠急性酒精灌胃48 h后肝脏中GSH水平回升，可能是机体自我修复的作用。因此，本研究中模型组小鼠肝脏GSH水平升高，可能与GSH水平应激性升高有关。乙醇氧化生成物在辅因子NAD+作用下产生NADH，从而降低NAD+与NADH的比率（NAD+/NADH）。NAD+/NADH比率降低能够通过减少脂肪酸氧化和增强脂肪酸合成促进肝脏中脂肪堆积[21]。本研究结果显示，小鼠一次性摄入大剂量酒精16 h后，模型组小鼠肝脏氧化还原状态失衡，脂肪异常聚集。与模型组相比，联合组小鼠肝脏MDA和TG水平下降，GSH表达升高，脂滴数量明显减少，表明姜黄素与富硒酵母联合干预能够减轻肝脏氧化损伤，改善脂肪堆积病理形态。

姜黄是一种药食同源植物，其主要活性物质姜黄素具有多种生理作用，但姜黄素含量少且生物利用度低[22]。近年来，天然产物和必需微量元素联合作为药物和保健食品开发受到越来越多的关注。KUMARI等[23]研究发现姜黄素负载硒纳米颗粒能够促进HTC116细胞周期停滞和凋亡，此外，降低了EAC荷瘤小鼠的肿瘤负荷并延长其存活时间。AL-DOSSARI等[24]研究报道姜黄素和硒联合干预7 d可以通过抑制炎症和氧化应激反应预防脂多糖或双氯芬酸诱导的肝脏损伤。也有研究发现姜黄素与硒联合给药能够增强机体抗氧化活性、减轻氧化应激水平，从而抑制CCl4诱导小鼠肝细胞癌的发生发展[25]。因此，本研究采用姜黄素天然产物与富硒酵母联合干预，观察到其联合作用能够预防保护急性酒精性肝损伤。

综上所述，姜黄素联合富硒酵母具有预防保护急性酒精性肝损伤的应用前景。本研究发现姜黄素联合富硒酵母能有效抑制肝脏肿大，降低肝脏MDA和TG水平，减少肝细胞脂滴沉积，同时上调GSH水平，提示姜黄素与富硒酵母联合可能通过减轻氧化应激水平和缓解脂质堆积，从而保护酒精诱导的急性肝损伤，其中作用的具体机制需要更深入研究。

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