冷冻猪肉食品中金黄色葡萄球菌的定性检测方法

慕礼霞 贺治芬

摘 要：目的：分析冷冻猪肉食品中金黄色葡萄球菌的污染情况。方法：2023年7—12月，随机抽选A市冷冻猪肉食品150份为研究样本。样本处理后分离菌株并培养，进行革兰染色和血浆凝固酶试验。观察金黄色葡萄球菌的生物学性状，统计冷冻猪肉样本中金黄色葡萄球菌的检出情况。结果：28份样本受到金黄色葡萄球菌污染，即金黄色葡萄球菌阳性检出率为18.67%。不同来源样本中，来源于农贸市场的样品阳性检出率为26.39%，高于商超的11.54%；不同类型样本中，纯肉类样品阳性检出率为30.00%，高于排骨类和脏器类的12.00%、14.00%；不同冷冻时间样本中，冷冻1、2、3个月的样品阳性检出率分别是17.74%、18.75%和20.00%。结论：农贸市场中的纯肉类冷冻猪肉食品，其金黄色葡萄球菌污染情况较严重，提示相关管理部门加强监管，以保障食品安全。

关键词：冷冻猪肉；金黄色葡萄球菌；分离培养；定性检测；市场监管

Qualitative Detection Method for Staphylococcus aureus in Frozen Pork Food

Abstract： Objective： To analyze the contamination of Staphylococcus aureus in frozen pork food. Method： From July to December 2023， 150 frozen pork foods from city A were randomly selected as research samples. After sample processing， isolate the strains and culture them for Gram staining and plasma coagulation enzyme test. Observe the biological characteristics of Staphylococcus aureus and count the detection of Staphylococcus aureus in frozen pork samples. Result： 28 samples were contaminated with Staphylococcus aureus， with a positive detection rate of 18.67%. Among samples from different sources， the positive detection rate from agricultural markets was 26.39%， higher than the 11.54% from supermarkets; in different types of samples， the positive detection rate of pure meat is 30.00%， which is higher than the 12.00% and 14.00% of pork ribs and organs; the positive detection rates for samples frozen for 1， 2， and 3 months at different freezing times were 17.74%， 18.75%， and 20.00%， respectively. Conclusion： The contamination of Staphylococcus aureus in pure meat frozen pork products in agricultural markets is severe， which suggests that relevant management departments should strengthen supervision to ensure food safety.

Keywords： frozen pork; Staphylococcus aureus; isolation and cultivation; qualitative testing; market regulation

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于革兰阳性菌的一种，在自然界中分布广泛。金黄色葡萄球菌具有较强的致病力，不仅会造成医院感染和社区感染，也是常见的食源性致病菌[1]。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌；我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生，在所有细菌性食物中毒事件中占比约20%[2-3]。近年来，人们的生活水平提高，饮食上的消费需求日益增加，猪肉已经成为餐桌上最普遍的食品，而金黄色葡萄球菌就是污染猪肉的致病菌之一，为人们的饮食安全带来隐患。现有研究中，冷冻猪肉食品中也有检测出金黄色葡萄球菌的情况[4]。本研究选取A市的冷冻猪肉食品为对象，对金黄色葡萄球菌开展定性检测，为相关防控管理工作提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

2023年7—12月，从A市随机抽选冷冻猪肉食品150份为研究样本。来源于农贸市场72份、商超78份；纯肉类50份、排骨类50份、脏器类50份；冷冻时间1个月62份、2个月48份、3个月40份；单个样本重量在100～500 g。在无菌条件下取样后，使用无菌袋封装，在-12 ℃下冷藏，及时送往实验室检测。

1.1.2 试剂与仪器

无菌氯化钠肉汤溶液（浓度7.5%），北京三药科技有限公司生产；血琼脂和Baird-Parker培养基，招远拓普生物工程公司生产；革兰氏染液试剂盒，北京奥博星生物技术公司生产。

电子秤、无菌均质袋、均质器、接种环、恒温培养箱、光学显微镜、一次性试管等。

1.2 方法

1.2.1 样本处理

从150份原始样本中，使用电子秤分别称取25 g装入无菌均质袋，编号为001#～150#。向袋中加入225 mL无菌生理盐水，利用均质器拍打2 min，使菌体分布到溶液中得到样品溶液。取5 mL样品溶液，接种在50 mL的无菌氯化钠肉汤溶液中，在37 ℃下培养24 h。

1.2.2 菌株分离培养

培养结束后，使用接种环蘸取样品溶液，并接种到血琼脂和Baird-Parker培养基上，注意进行Z字形划线操作。然后将培养基置于恒温培养箱中，設置温度为37 ℃，血琼脂培养基培养22 h，Baird-Parker培养基培养46 h。

1.2.3 革兰染色

在血琼脂和Baird-Parker培养基上，选择典型菌落涂片，使用革兰氏染液试剂盒染色，在光学显微镜下观察细菌形态。

1.2.4 血浆凝固酶试验

选择典型菌落接种到浸液肉汤中，在37 ℃下培养22 h；然后取0.5 mL菌液加入冻干兔血浆管内，混匀后在37℃下培养6 h。在此期间，每30 min观察一次，若发生凝固（试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固，则判定为阳性；若未发生凝固则一直观察，直至达到6 h培养时间依然未凝固，则判定为阴性[5]。

1.3 观察指标

①观察金黄色葡萄球菌的生物学性状，包括菌落形态、革兰染色特征和血浆凝固酶试验结果。②统计冷冻猪肉样本中金黄色葡萄球菌的检出情况，对比不同来源、不同类型、不同冷冻时间的样本中金黄色葡萄球菌的检出率。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的生物学性状

2.1.1 菌落形态

所有样本中有28份样本中分离的菌株，在血琼脂培养基上的菌落呈圆形、白色或金黄色，且表面湿润；在Baird-Parker培养基上的菌落呈黑灰色、边缘带透明光圈，且有一定硬度，以上形态特征和金黄色葡萄球菌的特性一致。

2.1.2 革兰染色特征

该28份样本中分离的菌株，经革兰染色后呈现出青紫色，符合革兰阳性菌的特征。在显微镜下观察，可见菌株呈圆形串状，没有荚膜和芽孢结构。

2.1.3 血浆凝固酶试验结果

该28份阳性样本中分离的菌株，血浆凝固酶试验结果均为阳性。

综合以上结果，可以判定28份样本受到金黄色葡萄球菌污染，即金黄色葡萄球菌阳性检出率为18.67%。

2.2 金黄色葡萄球菌的检出情况

2.2.1 金黄色葡萄球菌阳性样本的分布

150份冷冻猪肉样本中，共计检出金黄色葡萄球菌污染28份，阳性样本的分布情况见表1。

2.2.2 不同来源样本中金黄色葡萄球菌的检出率

不同来源样本中均检出金黄色葡萄球菌阳性，其中来源于农贸市场的样本阳性检出率为26.39%，高于来源于商超的样本为11.54%。见表2。

2.2.3 不同类型样本中金黄色葡萄球菌的检出率

不同类型样本中均检出金黄色葡萄球菌阳性，其中纯肉类样本的阳性检出率为30.00%，高于排骨类和脏器类的12.00%、14.00%。见表3。

2.2.4 不同冷冻时间样本中金黄色葡萄球菌的检出率

不同冷冻时间样本中均检出金黄色葡萄球菌阳性，冷冻1、2、3个月的样本阳性检出率分别是17.74%、18.75%和20.00%。见表4。

3 结论与讨论

3.1 金黄色葡萄球菌致病特点

金黄色葡萄球菌多呈球状或椭圆形，聚集排列类似葡萄串，可产生黄色的脂溶性色素，在血平板上的菌落呈金黄色。相关研究证实，金黄色葡萄球菌对干燥、热、盐等具有较强抵抗力，其在干燥的脓液中可存活2～3个月，在60 ℃环境中可存活

1 h，在10%的氯化钠溶液中能长期存活并繁殖[6]。该细菌不仅能寄居在人体皮肤表面，还会引起食物中毒，致病因子是病原体在食物中繁殖产生的肠毒素，导致人体出现急性胃肠炎症状。结合大量文献成果，若人体在进食24 h后出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等情况，怀疑是食物中毒，应及时到医院消化内科就诊[7-8]。近年来，随着人们的生活和饮食习惯改变，因食物污染、饮食不洁等引起的金黄色葡萄球菌中毒事件的发生率也在提高，提示消费者加以关注。

3.2 金黄色葡萄球菌的检测方法

目前，对于食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，主要是涂片镜检和分离培养。其中，涂片镜检是观察细菌的形态、排列特征和染色情况，可对金黄色葡萄球菌进行初步判定，该方法操作简单、用时短，但无法区分是否是致病菌。分离培养是将标本接种在培养基中，观察菌落特征进行鉴别，该方法的精准度高，但用时较长，一般需要3～5 d完成。贺生芳等[9]依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016），对两份样品进行金黄色葡萄球菌的定性检测，最终实验室的能力验证结果为“满意”。

此外，血浆凝固酶试验、酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、核糖体分型检测等，也是目前常用的检测技术。其中，血浆凝固酶试验可区分金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌；ELISA法是国际推荐的肠毒素分型检测技术，具有检测方便、灵敏度高的优点；PCR法不仅操作简单、用时短，而且灵敏度和特异性高。

本文对冷冻猪肉中的金黄色葡萄球菌进行检测，结果显示阳性检出率为18.67%。分析认为，金黄色葡萄球菌具有较强的环境适应能力，在低温冷冻条件下部分菌株处于亚致死状态，因此冷冻猪肉食品也可能存在污染情况。此外，本次研究还发现以下特征：①不同冷冻时间样本中，金黄色葡萄球菌的检出率无明显差异；②来源于农贸市场的样本阳性检出率明显高于商超样本，纯肉类样本的阳性检出率明显高于排骨类和脏器类。造成这一情况的原因可能和生产加工、冷冻环境、卫生管理等因素有关。

3.3 相关建议

结合本次研究结果，提示生产者、消费者和管理者加强防治力度，以保障饮食安全。①生产者层面，加强猪的饲养、屠宰、加工、冷藏及销售各环节的监管，严格落实检疫制度，实现猪肉从加工到餐桌全过程安全质量控制，消除金黄色葡萄球菌污染隐患。②消费者层面，要求民眾增强饮食安全意识，从正规渠道购买猪肉食品，仔细观察评估猪肉的品质；并采用科学的烹饪方法，食用前必须充分加热烧熟，加强卫生管理，杜绝金黄色葡萄球菌的产毒条件。③管理者层面，要落实市场监管工作，建立冷冻猪肉食品中金黄色葡萄球菌的危险性评估模型。要加大宣传教育力度，尤其餐饮企业和医疗卫生机构要落实自身职责，发挥出防治管理合力。

参考文献

[1]孟祥兆，李桂玲，陈勇，等.临床分离金黄色葡萄球菌的流行病学特征分析[J].中国卫生检验杂志，2014，24（7）：1040-1046.

[2]张鹏飞，阮傅倩，徐旭，等.陕西省和上海市市售猪肉中金黄色葡萄球菌分子多样性及耐药性研究[J].食品安全质量检测学报，2022，13（10）：3123-3133.

[3]LUZIA R，MICHAEL G，NICCOL? B，et al.Increase in methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bloodstream infections in Switzerland： a nationwide surveillance study （2008–2021）[J].Infection，2023，51（4）：1025-1031.

[4]吴任之，张翼，刘柳，等.生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的耐药特征、毒力基因及agr分型[J].微生物学杂志，2022，42（1）：34-42.

[5]邬元娟，张树秋，王文博，等.市售生猪肉中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药性分析[J].山东农业科学，2020，52（2）：140-143.

[6]韩国全，吴任之，张翼，等.猪肉源金黄色葡萄球菌生物膜能力与MLST分型检测[J].中国食品学报，2023，23（7）：353-362.

[7]陈威风，刘博，岳晓禹.金黄色葡萄球菌在生鲜猪肉中生长动力学模型构建[J].兽医导刊，2019（12）：214-215.

[8]何维凤，熊珍惜，范琳娟，等.一起金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒调查分析[J].应用预防医学，2022，28（4）：358-360.

[9]贺生芳，姜肖军，纳秀萍，等.食品中金黄色葡萄球菌的定性检测能力验证结果与分析[J].中国口岸科学技术，2021，3（10）：42-46.