破壁灵芝孢子粉中多种重金属元素及硒含量检测方法探讨

刘天益?李冰?李清清

摘 要：采用微波消解进行前处理，三重四极杆-电感耦合等离子体质谱法测定破壁灵芝孢子粉中镉、铬、镍、砷、铅、汞及硒元素含量，对方法条件进行优化和讨论，并对20批次破壁灵芝孢子粉进行测定。结果表明，镉、铬、镍、砷、铅和汞元素在氦气碰撞模式，硒元素在氧气反应模式下，采用内标校正定量，可达到良好的测定效果。在优化的条件下，各元素线性关系良好，检出限均可达μg·kg-1级别；镉、铬、镍、砷、铅及硒元素的加标回收率在90.3%～105.0%，汞的加标回收率在82.1%～92.5%；方法精密度在5%以内。此方法前处理操作简便，检测灵敏度高，稳定性好，给灵芝孢子粉多元素测定提供了良好的技术支撑。

关键词：破壁灵芝孢子粉；电感耦合等离子体质谱法；重金属；硒

Study on the Detection of Multiple Heavy Metal Elements and Selenium Content in Broken Ganoderma lucidum Spore Powder

Abstract： Microwave digestion was used for pre-treatment， and the content of lead， arsenic， mercury， cadmium， chromium， nickel， and selenium elements in broken Ganoderma lucidum spore powder was determined by triple four stage rod inductively coupled plasma mass spectrometry. The method conditions were optimized and discussed， and 20 batches of broken Ganoderma lucidum spore powder were determined. Experiments have shown that lead， arsenic， mercury， cadmium， chromium， and nickel elements can achieve good measurement results using internal standard calibration quantification in helium collision reaction mode and selenium element in oxygen reaction mode. Under optimized conditions， the linear relationship of each element is good， and the detection limit can all reach μg·kg-1 level. The recovery rates of lead， arsenic， cadmium， chromium， nickel， and selenium with added standards range from 90.3% to 105.0%， while the recovery rates of mercury with added standards range from 82.1% to 92.5%. The precision of the method is within 5%. This method has simple pre-treatment operation， high detection sensitivity， and good stability， providing good technical support for the determination of multiple elements in Ganoderma lucidum spore powder.

Keywords： broken Ganoderma lucidum spore powder; inductively coupled plasma mass spectrometry; heavy metal; selenium

靈芝孢子是灵芝的精华，它是灵芝在发育后期生长并释放出的种子，富含蛋白质及多种氨基酸，还含有丰富的生物多糖、萜类、生物碱、维生素，具有抑制肿瘤、增强免疫力的功效[1]。但灵芝孢子外层有几丁质外壁，难以被人体消化吸收，只有打开外壁后包裹中的有效成分才能有效释放并被人体利用吸收，所以灵芝孢子常使用生物酶解、化学、物理等方法进行破壁后，加工成灵芝孢子粉成品[2]。为了增加补充硒含量的功效，一些灵芝孢子粉在培养和生产过程中，会额外加入有机硒来源以提高破壁灵芝孢子粉中的硒含量。

随着破壁灵芝孢子粉产品的开发，其产品质量也越来越受到社会关注。由于灵芝孢子在自然生长过程中会富集一定的重金属元素，而重金属元素会在人体中富集产生不良影响，所以其产品中的重金属含量需要得到有效控制，同时，对于添加了硒来源的灵芝孢子粉也需要控制硒含量，以保证成品的食用安全性。目前，食品重金属和硒检测常用的方法主要有原子吸收光谱法[3-4]、原子荧光光谱法[5-7]、电感耦合等离子体发射光谱法[8-9]和电感耦合等离子体质谱法[10-12]，后两种方法是目前发展较为迅速、开发利用较广泛的元素检测方法，特别是在检测低含量水平的重金属元素方面，电感耦合等离子体质谱法具有检测灵敏度高、稳定性好，多元素同时分析等优点。本实验对破壁灵芝孢子粉中重金属元素、硒元素测定方法进行分析探讨，并检测了20批次市售破壁灵芝孢子粉成品中多种重金属和硒元素含量，为破壁灵芝孢子粉的食用安全性、营养价值评估及市场监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

破壁灵芝孢子粉20批次。多元素混合标准溶液（包含镉、铬、镍、砷、铅、硒）（100 mg·L-1，GSB 04-2825-2011，国家有色金属）；汞标准溶液（100 mg·L-1，GBW（E）080136，中国计量科学研究院）；硝酸（优级纯，国药试剂）；高氯酸（优级纯，国药试剂）；锗标准溶液（1 000 mg·L-1，G115415）、铑标准溶液（1 000 mg·L-1，G111458）、铼标准溶液（1 000 mg·L-1，G115448），均购自阿拉丁生化科技股份有限公司；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm，美国密理博公司）；ICP-MS调谐溶液（1 ?g·L-1，安捷伦科技有限公司）。

精密控温炉（北京普立泰科仪器有限公司）；微波消解系统（Mars 6，美国培安公司）；三重四极杆-电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MSMS 8900，安捷伦科技有限公司）；酸纯化系统（S1，上海屹尧仪器科技发展有限公司）。

1.2 样品前处理

（1）湿法消解。样品混匀后，精密称取1 g试样置于消解管内，依次加入硝酸10 mL和高氯酸

1 mL，置于精密控温炉100 ℃预反应30 min，后升温至180 ℃保持2～3 h，再升至220 ℃直至消化液无色或淡黄色澄清并冒白烟。若在消化过程中，消化液呈褐色，则应补加硝酸，消解至消化液无色或淡黄色澄清并冒白烟后取出消解管冷却，用超纯水洗涤两次，合并洗涤液并转移至50 mL容量瓶中，定容，待测，同时制备试剂空白。

（2）微波消解。样品混匀后，精密称取0.5 g试样置于微波消解罐内，加入5 mL硝酸并置于控温炉100 ℃放置30 min，后转入微波消解仪中，消解目标温度为190 ℃，升温30 min，保持30 min。消解程序结束后，冷却，将消解罐置于精密控温炉150 ℃加热，待样液剩余约1 mL时，取出冷却，用超纯水洗涤两次，合并洗涤液并转移至50 mL容量瓶中，定容，待测，同时制备试剂空白。

1.3 电感耦合等离子体质谱仪检测条件

载气采用高纯氩气（99.999 9%），等离子体气和辅助气流量分别设置为15.0 L·min-1、1.0 L·min-1；碰撞气采用高纯氦气，碰撞气流量3.0 L·min-1，反应气采用高纯氧气；等离子体射频发射功率1 350 W；采样深度5.0 mm；各元素检测质量数、对应内标元素及检测模式见表1。

2 结果与分析

2.1 消解条件的选择

2.1.1 消解方式的比较

采用湿法消解和微波消解对样品进行前处理，向破壁灵芝孢子粉基质中加入一定量镉、铬、镍、砷、铅、汞和硒标准溶液，比较2种消解方法的消解效果。试验表明，对于镉、铬、镍、砷、铅和硒等元素，2种前处理方法均可取得良好的消解效果，消解后的样品澄清无沉淀，且加标回收率在92.1%～103.5%，但对于汞元素，湿法消解的回收率只有70.3%～78.5%，说明在湿法消解的条件下，汞损失量较大，在同时测定包括汞元素在内的多种元素含量时，微波消解更适合作为前处理方法。

2.1.2 微波消解酸体系

在使用微波消解进行样品前处理时，其酸种类的选择对消解效果有较大的影响。硝酸具有强氧化性并有良好的微波吸收效果，是常用的微波消解酸种类，盐酸在高温高压下可以与许多盐类反应产生可溶性盐，过氧化氢有辅助氧化的效果，可以使样品消解更完全，消解液更清澈。试验对比了纯硝酸及硝酸和盐酸混合酸（5∶1）、硝酸和过氧化氢混合酸（5∶1）等3种消解液对消化的影响。结果表明，经3种消解液处理的灵芝孢子粉样品溶液均澄清透明，无沉淀、浑浊，考虑酸种类增加会增加试剂消耗，并使试验步骤更烦琐，同时可能带入污染和质谱干扰，故选择纯硝酸作为消解液。

2.2 质谱分析条件的选择

2.2.1 各元素检测质量数的确定

在选择目标元素的质荷比时，要考虑元素各质量数的丰度占比，一般选择较高丰度比的质量数以得到良好的响应值信号，还要考虑在质谱检测中多原子离子结合对目标质量数的干扰。铅、汞元素均属于高质量数，其在质量竞争中有较大优势，同时，两种元素均有多个质量数，其中铅丰度比较高的质量数为m/z=206、207、208，汞丰度比较高的质量数为m/z=199、200、201、202，对铅、汞元素的多原子离子干扰情况进行分析，在检测溶液中基本无可产生结合干扰的元素，故均选择最大丰度比质量数，即铅质量数m/z=208，汞质量数m/z=202；砷元素只有一个质量数即m/z=75，故使用此质量数；镉元素质量数中同位素丰度比较大的为m/z=110、111、112、113和114，其主要受多原子离子Ar、Ge和Pd、Sn、In同位素质量数的干扰，综合比較响应值和溶液中元素干扰情况，选择m/z=111为检测质量数；铬元素丰度比较大的质量数为m/z=52，但其受40Ar+12C干扰较严重，对低含量检测影响较大，所以选择次丰度比质量数为m/z=53；镍元素丰度比较大的质量数为m/z=58，但其受40Ar+16O和40Ca+16O干扰较大，所以选择次丰度比质量数为m/z=60；硒元素最大丰度比同位素质量数为m/z=80，但由于ICP-MS是氩气系统，硒主质量数受40Ar+40Ar干扰非常严重，无法使用此质量数检测，而经常使用m/z=78、82次丰度比质量数，但由于其丰度比较小，响应值较低，数据波动较大，经对同一样品溶液10次检测结果进行统计，其相对标准偏差为6.32%，故在本实验中选择80Se+16O即m/z=96进行检测，其响应值可提高5倍，对同一样品溶液10次检测结果进行统计，其相对标准偏差为2.32%，稳定性得到了明显提高。

2.2.2 检测模式的确定

为了最大限度消除多原子离子对目标元素质量数的干扰，在第一级四极杆选择所需要的目标质荷比之后，在第二级四极杆检测中选择氦气碰撞模式，其原理主要为在反应池中加入一路氦气对质谱中的多原子离子进行碰撞，消除结合体多原子离子干扰，但由于氦气的碰撞是无选择性的，此方法对目标元素灵敏度也有削减影响，故氦气流量不宜过高，实验表明，在氦气流量在3.0 L·min-1时，各元素灵敏度较为合适，不会对检测稳定性造成较大干扰，故选择此流量作为碰撞气体流量；由于硒元素m/z=78、82两个质量数的灵敏度都较小，加入氦气后其稳定性受影响较为严重，检测结果精密度较差，故实验在第二级四极杆中选择硒元素的主质量数m/z=80，再进行第三级四极杆检测，第三级四极杆检测中选择氧气反应模式，使硒元素和氧元素结合，检测质量数80Se16O即m/z=96，从而排除Ar元素的严重干扰，获得良好的灵敏度和稳定性。

2.2.3 内标元素的确定

为了校正样品溶液检测过程中雾化效率、仪器检测波动及质量歧视等质谱检测中常见稳定性影响因素，在样品进样时在线加入内标溶液，与样品溶液同时检测响应值，用内标溶液的响应值对样品溶液的响应值进行校正。样品溶液中应不含有内标元素，其质量数应与目标元素的质量数尽量接近，内标溶液的浓度应与标准曲线溶液在同一水平。经对样品溶液内标元素响应值及目标元素质量数的分析，各目标元素对应使用的内标元素如表2。

2.3 标准曲线和方法检出限

考虑到汞元素的挥发性和吸附性，汞元素配制单元素标准溶液，其标准曲线溶液浓度为0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1和3.0 μg·L-1，镉、铬、镍、砷、铅和硒配制混合标准溶液，其标准曲线浓度为1.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1，按照实验所得的优化条件对标准曲线溶液进行测定，以浓度为横坐标、响应值比为纵坐标绘制标准曲线。

按照微波消解前处理条件制备20个样品空白溶液，与标准曲线同样条件进行上机检测，得出20次空白溶液浓度并计算标准偏差，以称样量0.5 g定容体积50 mL计算，3倍标准偏差带入计算得到检出限，10倍标准偏差带入计算得到定量限。各元素线性关系和方法检出限、定量限结果见表3。结果表明，在优化的实验条件下各元素线性相关系数均大于0.999，定量限在3.21～85.6 μg·kg-1，可满足检测需求。

2.4 加标回收率

在低、中、高3个梯度浓度水平进行加标回收试验，镉、铬、镍、砷、铅和硒3个梯度水平分别为0.10 mg·kg-1、0.50 mg·kg-1、1.00 mg·kg-1，汞3個梯度水平分别为0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1，加标回收试验结果见表4。结果表明，镉、铬、镍、砷、铅和硒元素加标回收率在90.3%～105.0%；汞加标回收率在82.1%～92.5%。汞较其他元素回收率偏低，分析是由于汞为低温元素，在消化过程中有一定损失。根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[13]，各元素相应浓度的回收率均在可接受范围之内。

2.5 精密度

将灵芝孢子粉样品（以9号灵芝孢子粉为实例）同时处理6个平行样品，按照1.2.1条件进行前处理并在优化的仪器条件下上机检测，计算结果的平均值和相对标准偏差，考察方法精密度，结果见表5。实验结果表明，各元素的相对标准偏差为2.45%～4.85%，均满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）检测要求。

2.6 样品检测

实验收集了市售20个不同品牌、不同批次的破壁灵芝孢子粉样品，其中16～20号标明是富硒破壁灵芝孢子粉，按照上述优化的实验条件进行测定，结果见表6。

我国《保健食品原料目录 破壁灵芝孢子粉》中镉、铬、镍、砷、铅、汞的限量值分别为0.5 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，对产品进行分析。由表6可知，20批次破壁灵芝孢子粉中铅、砷、汞3个元素均在限量值内，镉元素除6号样品含量略超上限值，其他批次均在限量值内，但是铬和镍两个元素含量浮动较大，铬元素含量在0.005 67～15.40 00 mg·kg-1，其中6、7、15、16和18这5个样品铬元素超过2.0 mg·kg-1，且有两个样品超过10 mg·kg-1，应引起监管部门的重视；镍元素含量在0.005 95～8.880 00 mg·kg-1，其中7、11、12和15这4个样品镍元素超过1.0 mg·kg，且有两个分别为7.860 00 mg·kg-1和8.880 00 mg·kg-1，应引起监管部门重视。综上，市售破壁灵芝孢子粉总体质量情况良好，个别产品指标有不符合《保健食品原料目录 破壁灵芝孢子粉》要求的情况，特别是铬和镍元素需在监管中进一步得到关注。

3 结论

实验通过对前处理条件和仪器检测条件参数的分析和研究，建立了微波消解-三重四极杆-电感耦合等离子体质谱测定破壁灵芝孢子粉中6种重金属元素及硒元素的方法，并对此方法进行了方法学验证。实验表明，本研究建立的方法前处理时间短、效率高，检出限在μg·kg-1级别，检测精密度＜5%，可满足破壁灵芝孢子粉多种重金属元素和硒元素的检测需求，实验对20批次破壁灵芝孢子粉进行了检测，为监管部门提供了有效的数据支撑。

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