上转换荧光纳米材料免疫层析法快速检测恩诺沙星的研究

朱凡君 韦何雯 郭跃平 费建枫

摘 要：本研究旨在开发一种基于上转换荧光纳米材料的免疫层析法，以快速检测水产品中的恩诺沙星含量。上转换荧光纳米材料具备特殊的光学性质，能够提升方法的灵敏度和准确性。在抗体偶联pH值、标记荧光纳米粒径、检测线包被蛋白浓度达到最佳条件时，该技术方法的检出限为12.01 ng·mL-1，加标回收率为95.73%～115.03%，变异系数为7.78%～22.17%，检测过程约10 min。本方法为水产品中恩诺沙星的检测提供了参考，为检验方法的扩展提供了依据。

关键词：上转换发光纳米材料；免疫层析法；恩诺沙星；快速检测

Rapid Detection of Metronidazole by Immunochromatography with Upconversion Nanoparticles

Abstract： The purpose of this study was to develop an immunochromatography method based on upconversion fluorescent nanomaterials to rapidly detect the content of enrofloxacin in aquatic products. Upconversion fluorescent nanomaterials have special optical properties which can improve the sensitivity and accuracy of detection. Upconverted immunochromatography strips were prepared under optimal conditions by optimizing the antibody-conjugated pH， screening the labeled particle size， and determining the coating concentration. The detection limit of this technical method is 12.01 ng·mL-1， the recovery rate of spike is 95.73%～115.03%， the coefficient of variation is 7.78%～22.17%， and the detection process can only take about 10 minutes. This method provides a reference for the determination of enrofloxacin in aquatic products， and provides a basis for the expansion of the test method.

Keywords： up-conversion nanomaterials; immunochromatography; enrofloxacin; rapid detection

恩諾沙星属喹诺酮类抗生素，是一种广谱抗菌药物，具有杀菌作用，主要用于治疗动物的感染性疾病，其作用原理为抑制细菌的DNA回旋酶，从而阻止细菌的DNA复制和转录，起到杀菌作用[1-2]。常用于水产品感染性疾病及临床上细菌感染性疾病的防治，以保障动物的健康和生产性能[3]。而恩诺沙星会通过食物链进入人体，可能对人体健康产生潜在风险[4]。因此，对于恩诺沙星残留的检测显得尤为重要。目前，恩诺沙星残留的检测方法主要有高效液相色谱法[5]、液相色谱-质谱联用法[6]，这些方法虽然重复性好、检出限低，但样品前处理麻烦，且整个检测周期长、检测仪器昂贵、对操作人员要求高，不适于大批量样本和现场快速检测[7-8]。免疫层析技术是一种基于抗原-抗体特异性结合的快速检测技术，具有检测周期短、操作简便、灵敏高、特异强、成本低等优点，可适用于大批量样本和现场快速检测[9-10]。而时间分辨、量子点、上转换发光材料在免疫层析技术中得到了广泛发展和开发应用。免疫层析产品也从定性检测发展成了用设备定量检测，避免了因人眼观察检测线的有无或深浅带来的人为主观判读误差，使检测结果更加可靠、准确。本研究以镧系上转换发光材料为免疫标记物，采用近红外光作为激发光源，具有穿透能力强、避免生物样品的自体干扰等特点，开发一种灵敏度高、特异性好、抗干扰性强、可实现现场检测水产品中恩诺沙星的免疫层析试纸条。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗兔IgG、兔IgG、恩诺沙星抗原、Tween-20、Triton X-100，生工生物工程（上海）股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷、酪蛋白酸钠，N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

硝酸纤维素膜（NC膜），德国赛多利斯公司；玻璃纤维，上海杰一生物技术有限公司；上转换发光纳米材料，杭州胜行生物科技有限公司；DNA混合仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；高速离心机，塞洛捷克公司；荧光免疫分析仪，上海沫亘科技中心。

1.2 检测原理

免疫层析将纳米材料或荧光物质标记在检测抗体/抗原上，样本中的待测物质可与标记抗体（或抗原）、检测线上的抗体（或抗原）发生特异性反应，形成复合物并固定在检测线上，在特定波长的激发光照射下吸收能量，电子从基态跃迁到激发态，当其回到基态时，以发射光的形式释放能量，检测器检测发射光强度，而发光强度与检测物质的量相关，从而到达定量检测的目的。

1.3 实验方法

1.3.1 条件优化

（1）纳米材料标记pH值筛选。取3个离心管分别加入0.5 mg上转换发光纳米材料溶液，在超声条件下，使其充分分散。随后将其离心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液。通过加入1 mL吗啉乙磺酸溶液（MES，50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超声条件下使其重悬。重复上述步骤1次。加入一定量EDC和NHS于上述重悬溶液中，使其表面羧基活化。接着放入DNA旋转混合仪，离心去除上清液，用水混匀。再同样步骤离心1次。接着加入不同pH值（pH=5.0、pH=7.0、pH=9.0）的缓冲溶液，超声重悬。在离心管中加入恩诺沙星抗体，偶联2～4 h或4 ℃过夜。加入适量的BSA以封闭空白位点，40 min后放入离心机离心（12 000×g，5 min），加入保存液，超声重悬，重复上次步骤2～3次，最后得到修饰抗体后的荧光纳米颗粒溶液，4 ℃保存备用。

（2）标记纳米材料粒径筛选。取颗粒直径不同的荧光纳米材料（30 nm、60 nm和100 nm），在超声条件下，使其充分分散，随后将其离心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液，加入1 mL MES溶液（50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超声条件下使其重悬，重复1次上述步骤。加入一定量EDC和NHS于上述重悬溶液中，使其表面羧基活化。接着放入DNA旋转混合仪，离心去除上清液，用水混匀。再同样步骤离心1次。在离心管中加入恩诺沙星抗体，偶联2～4 h或4 ℃过夜。加入适量的BSA以封闭空白位点，40 min后放入离心机离心（12 000 r·min-1，5 min），加入保存液，超声重悬，重复上次步骤2～3次，最后得到修饰抗体后的荧光纳米颗粒溶液，4 ℃保存备用。

（3）检测线包被浓度确定。用缓冲液配制得到不同浓度的恩诺沙星抗原（0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1），并分别将其包被于检测线，同时将浓度为1.0 mg·mL-1羊抗兔IgG包被到NC膜上，在37 ℃条件下过夜孵育。将标记抗体的复合物喷于结合垫上，用荧光免疫分析仪检测结果，以阴性样本和阳性样本响应差值作为区分条件，差值越大，说明该条件下的检测效果越好。

1.3.2 样本处理及检测方法

（1）样本处理。取10 g牛蛙腿肉样本捣碎或搅碎，称取5 g于离心管中，加入5 mL样本提取液，充分摇匀振荡，并放入离心机离心（3 000 r·min-1，5 min），取上清液备用。

（2）检测方法。测试前，先将该样品的标准曲线录入荧光免疫分析仪中。取100 ?L上清液与200 ?L样本稀释液充分混合摇匀，取100 ?L滴加于免疫层析试纸条上，测定其恩诺沙星含量。

1.3.3 试纸成品性能分析

（1）准确性。取10 g牛蛙腿肉阴性样本进行加标回收试验，在相同检测条件下检测5次，计算平均加标回收率和变异系数（Coefficient of Variation，CV）。

（2）精密度。取一确认阳性的牛蛙样本，进行检测，通过检测结果计算精密度。

（3）检出限。检出限=20次空白样本平均值+3倍标准偏差。

2 结果与分析

2.1 标记抗体pH值确定

由表1可知，当抗体标记pH值为7.0时，阴性样本和阳性样本之间的差值最大，说明该条件下的检测性能最为可靠。因此选择pH值为7.0作为最优标记抗体pH值条件。

2.2 标记纳米材料粒径确定

将粒径为30 nm、60 nm、100 nm的上转换发光材料使用扫描电镜进行表征，结果如图1所示。在相同条件下标记恩诺沙星抗体，对比检测结果如表2所示，隨着纳米材料粒径增大，阴性样本和阳性样本之间的差值也变大。在本方案中，纳米材料粒径在100 nm时为最优。

2.3 检测线包被蛋白浓度确定

由表3可知，阴性样本和阳性样本之间的差值在包被浓度为1.0 mg·mL-1时最大，故选择包被浓度1.0 mg·mL-1为最优实验条件。

2.4 精密度、准确性

取相同批次生产的免疫试纸条，在同一牛蛙腿肉样本中添加不同浓度的恩诺沙星（20 ng·mL-1，50 ng·mL-1，100 ng·mL-1）进行检测。由表4可知，该方法的加标回收率为95.73%～115.03%，变异系数为7.78%～22.17%，说明该检测方法具有良好的精密度及准确性。

2.5 检出限

取20次空白样本进行检测，根据检测结果进行计算，该方法检出限为12.01 ng·mL-1。

3 结论

恩诺沙星作为一种兽药，因其高效、广谱和低毒等优点被广泛应用，但由于使用不规范，在食品、环境中造成药物残留，给消费者健康带来隐患，引起了各方面的重视。而准确、可靠的检测产品可满足快速精准的实时大批量现场检测的实际需求。本研究将上转换发光材料应用于免疫层析检测技术中，采用竞争法，对恩诺沙星进行定量检测分析，在最佳实验条件下，该方法检测限可达12.01 ng·mL-1，加标回收率为95.73%～115.03%，变异系数为7.78%～22.17%，检测时间仅为10 min，为水产品中恩诺沙星的检测提供了参考，为检验方法的扩展提供了依据。

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