circRNA 经由 ceRNA 机制调控 BMSCs 成骨分化在股骨头坏死中的研究进展

柳可心 刘凯 冬梅 王建忠

股骨头坏死 ( osteonecrosis of the femoral head，ONFH )是骨科常见病和难治性疾病，发病机制为股骨头血供受损或中断引起股骨头缺血、坏死，最终出现股骨头塌陷、关节功能障碍等症状。研究调查显示 ONFH 发病人数呈逐年上升趋势，好发于 30～65 岁人群，并逐渐趋于年轻化，其中 30%～70% 的病例出现双侧股骨头坏死，严重影响患者的生活[1]。按照病因 ONFH 主要分为创伤性股骨头坏死( traumatic-induced osteonecrosis of femoral head，TIONFH )和非创伤性股骨头坏死 ( non-traumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH )，前者主要由股骨颈骨折、髋关节脱位等外伤引起，后者在我国的常见原因为糖皮质激素和酒精的过量使用[2]。因 ONFH 早期症状不明显，多表现为髋关节的疼痛，且 X 线片检查对早期的细微骨质病变不敏感，所以很容易被忽视，往往错过最佳治疗时间。晚期的 ONFH 常伴随股骨头塌陷，人工髋关节置换术成为患者不可避免的选择[3]。该病给患者带来巨大经济负担和精神压力，因此亟需确定新的诊断标志物以提高 ONFH 的早期检出率，并为临床靶向治疗提供理论基础。骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )具有多方向分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞等的潜能，是髓腔内成骨细胞的主要来源[4]。研究表明，坏死的股骨头中 BMSCs 的数量和成骨分化能力降低[5]，与ONFH 的进程有着密切关系。随着高通量测序技术的发展，环状 RNA ( circular RNA，circRNA ) 成为微小 RNA( microRNA，miRNA ) 及长链非编码 RNA ( long noncoding RNA，LncRNA ) 后新的研究热点。近年来，越来越多的研究证实 circRNA 主要通过竞争性内源 RNA ( competing endogenous RNA，ceRNA ) 机制调控 BMSCs 成骨 / 成脂分化，参与 ONFH 的发生发展[6]。因此，研究 circRNA 在BMSCs 成骨分化中的作用及其影响 ONFH 的发生发展机制，可以为 ONFH 的早期诊断和治疗提供新的策略。

一、circRNA 概述和生物功能

circRNA 是一类广泛存在于真核细胞中的非编码RNA，主要存在于真核细胞的细胞质中，具有共价键首尾相连形成的闭合环状结构[7]。与标准线性 RNA 不同，circRNA 不含 5’ 端帽子与 3’ 端多聚 A 尾结构，因此不受RNA 外切酶的影响，具有高稳定性，不易被降解[8]。起初circRNA 被认为是错误剪接或信使 RNA ( messenger RNA，mRNA ) 产生过程的副产物，随着高通量测序技术和生物信息学研究方法的快速发展，在多种物种中发现大量的circRNA。多项研究发现 circRNA 是调控细胞分化、维持组织稳态等疾病生理病理过程中的重要参与者[9-11]。这表明circRNA 并非 mRNA 剪接的稳态副产物，而是一类在细胞中发挥重要作用的 RNA 分子，成为非编码 RNA 领域的明星分子。根据 circRNA 的来源不同，可分为四类：( 1 ) 外显子环状 RNA ( exonic circRNA，EciRNA )；( 2 ) 内含子环状 RNA ( intronic circRNA，ciRNA )；( 3 ) 外显子 - 内含子环状 RNA ( exon-intron circRNA，ElciRNA )；( 4 ) 来源于反义链转录本的反义环状 RNA ( antisense circular RNA ) 以及基因间序列或其它未注释基因组序列的环状 RNA ( intergenic circular RNA )[12]。其中 EciRNA 占已知 circRNA 的 80% 以上，且比其它类型的 circRNA 更具序列保守型[13]。

1. miRNA 的分子海绵：miRNA 通过与靶基因中 3’ 端非翻译区域 ( 3’UTR ) 结合抑制靶基因的翻译，而 circRNA富含 miRNA 的结合位点，可以起到 miRNA 海绵的作用，通过直接与 miRNA 结合影响 miRNA 对靶基因 3’UTR 的结合，产生相应的生物学效应[14]。研究发现，circ_0015382在先兆子痫 ( pre-eclampsia，PE ) 胎盘组织中高表达，由于它能有效结合 miR-149-5p 而使 miR-149-5p 的活性下降，导致 miR-149-5p 靶基因的表达水平增加，进而抑制滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成，加快 PE 的进展[15]。Zhang 等[16]证实 circFCHO2 作为 miR-194-5p 的海绵通过 JAK1 / STAT3 途径促进体内胃癌细胞的生长和肺转移。此外，circRNA 通过 ceRNA 机制在多种疾病中发挥作用。

2. 作为翻译模板：circRNA 虽然属于非编码 RNA，缺乏 5’ 端帽子与 3’ 端多聚 A 尾结构，但随着对 circRNA研究的深入，发现有少数 circRNA 序列中含有开放阅读框 ( open reading frame，ORF )、N6-甲基腺苷 ( N6-methyladenosine，m6A ) 修饰和内部核糖体进入位点( internal ribosome entry site，IRES )，能够以不依赖帽子结构的方式进行翻译[17]。目前，已经证实很多 circRNA 可以作为翻译模板，为细胞提供生存所需的重要蛋白质。例如，circ-ZNF609 在肌肉形成过程中具有编码蛋白的作用，并且热应激 ( 2 h 44 ℃ ) 能使 circ-ZNF609 的翻译能力增强[18]。Jiang 等[19]发现胃癌组织中环状促分裂原活化蛋白激酶 1 ( mitogen-activated protein kinase 1，circMAPK1 )( hsa_circ_0004872 ) 相较于邻近的正常组织表达水平下调，并证实其可通过编码一种长度为 109 个氨基酸的新型蛋白质 MAPK1-109aa 抑制肿瘤的增殖和侵袭。circRNA 可作为翻译模板的发现颠覆了以往只有 mRNA 才具有翻译功能的认知，也进一步丰富了对人类基因组翻译领域的研究。

3. 与蛋白质相互作用：circRNA 和蛋白质的相互作用对于 circRNA 的合成与降解及蛋白的表达与功能都会产生影响。RNA 结合蛋白 ( RNA binding protein，RBP ) 是一类与 RNA 的代谢加工相关的蛋白质，参与 RNA 的成熟、运输、定位和翻译[20]。circRNA 可以与特定的 RBP 结合，调节 RBP 与其靶 RNA 之间的相互作用[21]。人类抗原 R( human antigen R，HuR ) 是一种被广泛研究的 RBP，研究发现 circAGO2 在胃癌[22]、结肠癌[23]、前列腺癌[24]和神经母细胞瘤[25]中上调，能够与 HuR 蛋白结合并激活 HuR，促进 HuR 在靶基因的 3’UTR 富集，导致 argonaute 2 ( AGO2 )蛋白与靶基因的结合减少，进而抑制 AGO2 / miRNA 沉默复合体介导的基因沉默效应，加速癌症进展[26]。细胞周期蛋白依赖性激酶 2 ( cyclin-dependent kinase 2，CDK2 ) 是一种丝氨酸 / 苏氨酸 ( Ser / Thr ) 蛋白激酶，通常 CDK2 与细胞周期蛋白 A 和细胞周期蛋白 E 相互作用以促进细胞由 G1 期进入 S 期，是细胞周期转变的必需物质[27-28]。Du 等[29]发现 circ-Foxo3 可与 CDK2 和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p21 结合形成三元复合物，该复合物消耗了CDK2，阻止细胞由 G1 期进入 S 期，从而影响细胞周期进程和细胞增殖。

4. 参与转录调节：circRNA 主要以外显子的形式存在于细胞质中，但其它类型 circRNA 具有的特性同样值得一提。ciRNA 可与 RNA 聚合酶 Ⅱ ( polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ ) 结合调节基因转录。Zhang 等[30]鉴定出 ci-ankrd52 作为 Pol Ⅱ的正调控因子进而促进亲本基因表达。此外，ElciRNA 可与小核糖核蛋白 ( small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs )相互作用，再与 Pol Ⅱ 结合调节转录[31]。Li 等[32]发现ElciRNA，如 circEIF3J 和 circPIAP2，可与 snRNPs 相互作用促进亲本基因的转录。

二、BMSCs 与 ONFH 的关系

Friedenstein 等[33]首次在骨髓中发现 BMSCs，其在特定诱导条件下可以发育为成骨细胞[34]、脂肪细胞[35]、软骨细胞[36]、神经细胞[37]等。因其具有多向分化的潜力，在基因治疗、组织工程、细胞替代治疗和再生医学等领域中已成为极其重要的种子细胞。

BMSCs 的成骨 / 成脂分化平衡在维持股骨头的结构和功能的完整性中起着关键作用。在正常情况下，BMSCs 成骨分化和成脂分化能力处于动态平衡，当这一平衡遭到破坏，就会引起骨科疾病[38]。ONFH 患者 ONFH 区域成骨能力降低，相反成脂能力却明显增强[39]。随着对 BMSCs 认知的不断深化，BMSCs 为治疗 ONFH 提供了新方向。例如，BMSCs 可以分泌细胞因子，通过旁分泌效应促进坏死区的血液供应[40]。Ma 等[41]在动物实验中探讨了血管内皮生长因子-165 ( vascular endothelial growth factor 165，VEGF-165 ) 与骨形态发生蛋白-2 ( bone morphogenetic protein 2，BMP-2 ) 基因修饰的 BMSCs 对 ONFH 的治疗作用，结果表明 VEGF-165 / BMP-2 基因转染可促进 BMSCs的成骨分化，有益于 ONFH 的修复。此外，利用各种物理手段如体外冲击波[42]及化学药物如淫羊藿苷[43]、丙戊酸[44]等可促进 BMSCs 成骨分化，在 ONFH 相关的临床前实验中取得较好的效果并逐渐应用于临床。髓芯钻孔减压并自体 BMSCs 注射移植有效改善了患者骨髓腔内高压引起的微循环障碍[45]。BMSCs 注射移植在治疗早中期 ONFH取得较好疗效，可降低股骨头塌陷发生率[46]。总之，BMSCs 是 ONFH 发生发展的重要因素，在 ONFH 早中期以 BMSCs 为靶点对疾病进行干预，可以极大地改善患者预后。

三、circRNA 经由 ceRNA 机制调控 ONFH 中BMSCs 成骨分化

1. 促进 BMSCs 的成骨分化：circRNA 在细胞和组织中广泛表达，Xiang 等[39]分析了从 ONFH 患者分离的 BMSCs中异常表达的 miRNA 和 circRNA，证实了 circRNA 可以通过 ceRNA 机制作用于相关信号通路介导 BMSCs 成骨、成脂分化来参与 ONFH 的进展。Hao 等[47]发现激素性股骨头坏死 ( steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SONFH ) 的大鼠股骨头 BMSCs 中 circPVT1 表达水平降低而 miR-21-5p 上调。通过体内实验证实：上调的 circPVT1通过 ceRNA 机制作为 miR-21-5p 的分子海绵，抑制miR-21-5p 与 Smad7 的 3’UTR 的结合，促进 BMSCs 成骨分化，通过 circPVT1-miR-21-5p-Smad7 / TGFβ 轴来影响SIONFH 的发展。Liu 等[48]发现 circ_AFF4 在 BMSCs 的成骨分化诱导过程中明显增强，而 miR-135a-5p 的表达水平则显著下降，下调 circ_AFF 能够显著抑制 BMSCs 的成骨分化潜能。使用生信分析预测 miR-135a-5p 为 circ_AFF4的潜在靶点，通过荧光素酶报告实验和 RNA-pull down 实验证实 circ_AFF4 作为 miR-135a-5p 的海绵，通过激活SMAD1 / 5 途径诱导 BMSCs 的成骨分化。Xin 等[49]发现Circ_0066523 在 BMSCs 的成骨分化过程中过表达，通过体外实验发现沉默 Circ_0066523 阻碍 BMSCs 的增殖和成骨分化。后续实验证实了 circ_0066523 通过磷酸酶和张力蛋白同源物 ( phosphatase and tensin homolog，PTEN ) /磷脂酰肌醇 3 激酶 ( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K ) /蛋白激酶 B ( protein kinase B，PKB，又称 AKT ) 途径促进 BMSCs 的增殖和成骨分化。基于 GEO 数据库和实时荧光定量聚合酶链反应 ( real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR ) 测定，Chia 等[50]发现过表达的 circ-DAB1 ( has_circ_0113689 ) 会促进 BMSCs的增殖和成骨分化，而沉默 circ-DAB1 引起相反的功能。进一步实验证明 circ-DAB1 通过 miR-1270 / miR-944 /RBPJ 途径上调 DAB1 并促进 BMSCs 的细胞增殖和成骨分化。Huang 等[51]通过 RT-qPCR 发现 circ_0067680 在成骨分化过程中在 BMSCs 中过表达，敲低 circ_0067680 抑制 BMSCs 的成骨分化。进一步通过 RNA-pull down 实验、RNA 免疫共沉淀 ( RNA immunoprecipitation，RIP ) 和荧光素酶报告基因分析证明，circ_0067680 作为 miR-4429 的海绵调节 CTNNB1 表达，从而通过激活经典的 Wnt / β-catenin信号通路促进 BMSCs 成骨分化。Xiang 等[39]为了研究 BMSCs 功能改变与 ONFH 之间的相关性，通过分析从 ONFH 患者分离的 BMSCs 中异常表达的 miRNA 和circRNA，并进一步探索 circRNA 在 ONFH 中作用的潜在调节机制。结果表明，hsa_circ_0000219 和 hsa_circ_0005936分别作为 miR-144-3p 和 miR-1270 的分子海绵，抑制其与靶基因 3’UTR 结合，促进 BMSCs 的成骨分化，进而延缓ONFH 的进展。

2. 抑制 BMSCs 的成骨分化：尽管许多 circRNA 在BMSCs 的成骨分化中起到了促进作用，但在持续的探索中，也发现许多可以抑制 BMSCs 成骨分化的 circRNA。Chen 等[52]在 SONFH 来源的 BMSCs 中检测到 circRNA CDR1as 过表达。上调 CDR1as 会导致 BMSCs 成骨分化降低，脂肪分化增加。荧光素酶报告基因检测证实 CDR1as和 WNT5B 的 miR-7-5p 结合位点，表明 circRNA CDR1as可能通过 CDR1as-miR-7-5p-WNT5B 轴在 BMSCs 的成骨 / 成脂分化中起关键作用。Kuang 等[53]在 SONFH 和TIONFH 患者的股骨头组织中均检测到 circUSP45 的表达水平上调，进一步实验发现上调的 circUSP45 通过 ceRNA机制作为 miR-127-5p 分子海绵，进而抑制 miR-21-5p 与PTEN 的结合，通过抑制 AKT 信号通路来抑制 BMSCs 的成骨分化，影响 ONFH 的进程。Zhang 等[54]对 TIONFH 血液样本进行测序后发现众多差异性表达的 circRNA，后续对 TIONFH 患者的 BMSCs 和破骨细胞样细胞 ( osteoclastlike cell，OLC ) 进行监测，验证了 circRNA_25487 作为miR-134-3p 的分子海绵，抑制了 miR-134-3p 与 p21 的结合从而抑制 BMSCs 成骨分化。Han 等[55]发现 circ_0058792相对于健康个体明显上调，而 miR-181a-5p 则下调。沉默circ_0058792 和过表达 miR-181a-5p 后会显著提高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。后续证实 circ_0058792 作为miR-181a-5p 的分子海绵，通过 TGF-β / Smad7 途径来调节 BMSCs 的成骨分化。Feng 等[56]利用 circRNA 微阵列检测 ONFH 的 BMSCs 中 circRNA 表达谱，进一步研究了上调最显著的 circHGF 对 BMSCs 的增殖和成骨分化的影响。实验证实 circHGF 通过 ceRNA 机制与 miR-25-3p 结合，抑制 miR-25-3p 与靶基因 SMAD7 的 3’UTR 结合，抑制了BMSCs 的增殖和成骨分化。以上 circRNA 经由 ceRNA 机制对 BMSCs 成骨分化的调控作用见表1。

四、临床价值

1. 疾病诊断：早诊早治 ONFH 是延缓股骨头塌陷及改善预后的重要举措。大多数 circRNA 在不同物种间序列具有高度保守性，且在不同组织和发育阶段选择性表达，在血清和组织中具有高稳定性。因此，circRNA 有作为反映疾病诊断和预后的潜在生物标志物的潜力。Jiang 等[57]使用 RT-qPCR 检测了 NONFH 患者血浆和局部 circCDR1as 的表达水平。结果与健康对照组相比后发现 NONFH 患者的血浆 circCDR1as 表达显著增高，局部坏死组织中的 circCDR1as 显著高于邻近的非受累组织。更重要的是 circCDR1as 的表达水平与疾病的严重程度呈正相关：与 ARCO 1 / 2 期相比，ARCO 3 期患者的血浆和局部 circCDR1as 表达明显上调；同样，与 ARCO 3 期相比，ARCO 4 期患者的血浆和局部 circCDR1as 表达明显上调。通过接收者操作特征 ( receiver operating characteristic，ROC ) 曲线分析表明，血浆中 circCDR1as 的表达水平可作为 NONFH 患者疾病严重程度的良好评价指标。相信未来可通过抽取血液、穿刺局部样本或利用基因芯片技术快速筛查异常表达的 circRNA，为 ONFH 的早期诊断、病情监测提供有效的数据支持。

2. 疾病治疗：由于 ONFH 的后期致残率高，股骨头塌陷疼痛，关节功能障碍，严重影响患者生活质量，晚期多需要进行人工髋关节置换术。虽然手术治疗有较好的效果，但创伤大、费用高、患者恢复周期较长等问题很大程度限制了手术的治疗方式。以特定 circRNA 为靶点的精准医疗成为研究热点。孙含瑞[58]证明 circRNA-25487 表达水平的高低与 TIONFH 患者和股骨颈骨折未坏死患者的BMSCs 成骨增殖、分化能力均呈负相关。通过茜素红染色、碱性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 染色发现，补肾活血药可以调节 circRNA-25487 的基因表达水平，进而调控 BMSCs 的成骨分化能力。该研究为 BMSCs 成骨能力的调控机制提供有力实验依据，为临床早期防治 ONFH 提供新的方法。在未来，相信通过调控特定 circRNA 的表达以促进 BMSCs 成骨分化会为治疗 ONFH 提供更多可能。

五、总结和展望

ONFH 的发病机制复杂，致残率高，并逐渐趋于年轻化，所以早期诊断、治疗尤为重要。近年来，随着分子生物学技术的不断发展与成熟，已有大量研究表明，circRNA经由 ceRNA 机制介导 TGF-β / SMAD、PI3K / AKT、NOTCH和 Wnt / β-catenin 等信号通路调控 BMSCs 成骨分化在ONFH 病程发展中发挥重要作用。目前，circRNA 相关研究尚处于起步阶段，研究方向集中于 ceRNA 调控网络。在未来，circRNA 与蛋白结合、作为翻译模板、调控基因转录等功能是否存在于 ONFH 的发生发展中有待深入探究。此外，需要更多的基础研究和临床试验去探寻circRNA 调控 BMSCs 的成骨分化以外的调控 ONFH 的相关机制，如影响成骨细胞和破骨细胞的活性、血管内皮细胞损伤和软骨细胞的分化等。随着研究的深入，ONFH 的早期防治、诊断和治疗有望提升到分子水平，或可通过基因芯片快速筛查异常表达的 circRNA，提高 ONFH 早期检出率，并以 circRNA 为靶点为 ONFH 的早期诊断和治疗提供新的视角。