基因编辑猪在异种肝脏移植中的研究进展

张家腾 李家琦 武羽 段钟平 陈煜

终末期肝病(ESLD)泛指各种肝脏损伤导致的肝病晚期阶段。每年约有200万人因肝病死亡,肝移植是治疗终末期肝病最有效的方法。随着肝移植技术、免疫抑制剂和医疗保健等方面的发展,肝移植术后存活率逐步提高,其需求也在不断增加[1]。然而,由于供肝的数量极大地受限于传统观念、伦理道德等多重社会因素的影响,器官捐献者短缺已成为我国乃至全世界共同面临的严峻挑战,潜在的移植受者数量更是远远超过肝脏供体数量。肝移植为第二常见的实体器官移植,但根据记录在案的移植器官统计,全球只有不到10%的移植需求得到满足[1]。当前供肝数量的匮乏已成为阻碍肝移植发展的最大问题,因此开发其他来源的肝脏替代方案至关重要,而异种肝脏移植的发展为终末期肝病患者带来了新的希望。近年来,猪在异种器官移植领域的应用不断扩大。基因编辑技术进步的同时,基因编辑猪的构建方案也在不断优化,这极大地推动了异种器官移植的发展。

一、 异种器官移植的供体选择

灵长类动物中,类人猿、黑猩猩、狒狒、猴子等,进化程度与人类更为接近,理论上,这些高级的非人类灵长类动物是用于异种器官移植的理想供体来源,但由于其数量少、价格贵,繁殖周期长、饲养困难,以及伦理等问题不适合作为异种器官移植的供体来源。小型猪是一种新型医学实验动物模型,广泛应用于心血管疾病、消化系统疾病的研究及器官异种移植等领域[2]。小型猪品种资源丰富、体型小、易繁殖、存活率高、遗传性状稳定,且在遗传学、解剖结构、器官大小、营养代谢及生理生化特征方面与人的相似性较大,具有广阔的应用前景[2]。同时,由于猪与人类在进化上的亲缘关系相距较远,与使用非人类灵长类动物相比,受者患人畜共患病的风险较小,引发的伦理争议也较少。重要的是,猪也易于进行基因修饰,因此目前被认为是异种器官移植的最佳供体选择。

二、 异种器官移植面临的问题

利用猪作为潜在的人类移植器官的供体选择是解决当前器官严重短缺问题的重要途径,但同时也面临着诸多挑战:①受体与供体之间的高免疫不相容性是异种器官移植的主要障碍。主要包括超急性排斥反应(HAR)、急性体液异种移植排斥反应(AHXR)、急性细胞排斥反应(ACR)、慢性排斥反应。②潜在的猪内源性逆转录病毒(PERVs)的跨物种感染风险,也是异种器官移植的必要安全考虑。③凝血功能障碍:血小板减少症和凝血失调。

超急性排斥反应通常发生在移植后数分钟或数小时内,由α1,3-半乳糖基抗原介导,当异种移植物移植到受者体内时,移植物细胞表面抗原与受者体内的抗体IgG和IgM结合,形成抗原抗体复合物,从而激活补体调控系统,导致血管内血栓形成、出血性坏死、内皮细胞损伤以及IgM、IgG沉积等[3]。急性体液异种移植排斥反应,又称急性血管排斥反应,在移植后2～3 d内发生,其与激活内皮的抗体和补体的沉积以及先天免疫细胞(例如多形核白细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK cell))的浸润作用有关。急性细胞排斥反应,又称急性排斥反应,其发生早期是由细胞免疫导致,主要由NK细胞和主要组织相容性复合物(MHC)激活T淋巴细胞介导。ACR的形成主要取决于多肽的类型,例如,Ⅰ类MHC主要激活CD4+T细胞,Ⅱ型MHC主要激活CD8+T细胞。慢性排斥反应即移植物血管病变,一般发生在移植术后数月或数年内,也可发生在急性排斥反应后,以体液免疫为主,产生血管周围炎症,阻塞血管,导致移植物功能逐渐下降。

猪器官携带的病毒和微生物对移植受体存在的潜在危害性也是值得关注的一个问题。通过改善猪群的饲养环境,定期进行安全监测可以有效规避巨细胞病毒、EB病毒、西尼罗病毒、狂犬病毒等病毒感染的发生。然而猪体内还存在一种单链正链RNA病毒,即猪内源性逆转录病毒,它可以将RNA转为DNA并整合到猪基因组中。猪体内部分细胞可以释放PERV颗粒,在体外感染某些人源细胞,使受体有致病和感染的可能[4]。尽管目前还未有异种器官移植感染PERV的报道,但仍旧存在病毒传播及引发疾病的风险,因此这也是需要解决的问题之一。

由于血小板丢失导致的致命性出血及凝血失调等问题尚未解决,猪异种肝脏移植的存活时间限制在1个月内[5]。目前认为,异种肝脏移植后严重的血小板减少是由于血小板过度活化/聚集和异常的血小板隔离/吞噬作用造成的。凝血级联的异常激活是超急性排斥反应的标志特征。然而,在猪-非人类灵长类动物肝脏异种移植中,即使没有发生超急性排斥反应,也会发生凝血失调。与心脏或肾脏异种移植相比,凝血失调对肝脏异种移植来说是一个更大的障碍[6]。研究显示,肝脏异种移植中凝血失调的影响因素包括组织因子的遗传不一致、外源性途径的组成性激活以及凝血酶-血栓调节蛋白复合物中的物种不相容性[6]。

三、基因编辑猪的构建

由于免疫补体系统的激活、凝血系统紊乱及猪器官本身携带病毒等问题的存在,限制了异种器官移植的应用。基因编辑技术的发展对解决这些问题做出了巨大贡献。从最初的通过原核显微注射、精子介导的基因转移和移动遗传元件的整合等方法随机插入外源 DNA,再到通过体细胞中的同源重组和体细胞核移植来操纵内源基因[7],已成功构建了多种基因编辑猪,但上述技术在猪成纤维细胞中获得基因敲除的效率仍非常低。

近年来,核酸酶介导的基因编辑技术大大提高了获得基因敲除细胞的效率,使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸内切酶(TALENs)和成簇的规则间隔短回文重复序列/Cas9系统(CRISPR/Cas9)等新型可编程DNA核酸酶在基因组编辑方面的应用取得了重大进展[8]。这些工具能够通过靶向特定序列来精确切割DNA,并通过切断特定基因组位点的双链来添加、去除或替换核苷酸。特别是CRISPR/Cas9技术,与其他基因组编辑工具依赖于蛋白质-DNA相互作用不同,该技术依赖于RNA-DNA结合,这使该系统具有更高的灵活性和保真度,同时操作相对简单且更具有成本效益,在构建基因编辑猪中发挥重要作用。

通过针对异种抗原分子、免疫反应调节因子、凝血反应调节因子等靶基因,可构建转基因猪。研究发现,猪器官的血管内皮细胞存在大量的α-1,3-半乳糖抗原,其合成由α-1,3-半乳糖苷转移酶(GGTA1)催化,该酶在人体中不存在,因此会被人免疫系统产生的抗α-1,3半乳糖抗体识别,从而发生免疫排斥反应。敲除该基因,获得转基因猪(α-1,3-galactosyltransferase gene knockout,GTKO),可有效规避此情况的发生[9]。有试验显示,使用GTKO猪的心脏并结合免疫抑制剂,移植到狒狒体内,受者存活时间长达179 d[10]。研究者们还利用其他基因如CD46、CD55、CD59、CD39、CD47等,对猪进行基因改造,从而延迟异种移植排斥和/或急性细胞排斥、抑制补体活性[11]。此外,在供体猪中也已通过CRISPR/Cas9技术敲除了PERV,实现了PERV敲除猪的选育[12, 13]。总之,利用基因修饰猪作为器官供体并合用免疫抑制剂,可以有效降低异种器官移植免疫排斥反应,这也是目前异种器官移植的主要发展途径。

四、 基因编辑猪在异种肝脏移植中的研究进展

基因编辑猪模型在推动异种肝脏移植领域发挥了极其重要的作用[14]。2000年,有研究者使用表达CD55的转基因猪首次进行了基因编辑猪-狒狒原位异种肝移植,并与未修饰猪进行对比,结果显示,使用未修饰猪进行肝脏移植的三只对照动物由于发生HAR,存活时间不到12 h,而使用转基因肝脏的动物在移植术后未发生HAR,最终狒狒存活8 d[15]。此后,又有研究人员使用表达人补体调节蛋白CD55、CD59和α1,2-岩藻糖基转移酶的多转基因猪在狒狒中进行肝脏原位异种移植,最终结果显示未发生HAR,但由于受体发生血栓,存活时间仅为13～24 h[16]。2010年,研究者首次进行了GGTA1基因敲除猪-狒狒异种肝脏移植的试验,并对移植肝脏的凝血功能、解毒功能及补体活性进行检测,结果显示供体肝脏可以正常发挥肝脏功能,最终由于血小板减少引发了严重的自发性出血,存活时间为4～7 d[17]。研究表明,GTKO猪进行异种肝脏移植能有效延长移植物存活时间,而目前影响移植物存活的主要因素是血小板减少导致微血管病变及凝血功能紊乱[17]。2012年,有研究者使用GTKO猪进行肝脏异种移植,并对受者进行术后Amicar治疗(适用于预防及治疗血纤维蛋白溶解亢进引起的各种出血),以抑制纤维蛋白溶解,最终将受者的生存时间延长至9 d[18]。

直到2016年,有研究者利用GTKO猪,并在移植后连续输注人凝血酶原复合物浓缩物以及添加贝拉西普进行肝脏原位异种移植,使受者存活了25 d[19]。一年后,该研究团队保持其他实验参数不变,仅用抗CD40单抗取代贝拉西普作为共刺激的主要药物,用来延长异种肝脏移植的生存时间,试验过程中未出现排斥反应、炎症或血栓性微血管病,最终受体由于足底溃疡和肝功能升高需要进行安乐死,但生存时间长达29 d,这也是目前猪肝异种移植的最长时间记录[5]。然而尽管基因编辑猪的技术不断发展,但血小板减少症和凝血失调的存在仍极大地限制了临床前异种肝脏移植的存活时间。

五、 展望

随着器官移植技术的不断进步,供体资源紧缺已成为日益严峻的全球性问题,严重阻碍了器官移植的发展。以基因编辑猪为供体的异种器官移植有望解决器官供需失衡的问题。近年来,基因编辑技术发展迅速,通过敲除异种抗原基因,转入表达人体补体调节基因,敲除免疫激活因子,表达抗凝血/抗血栓调控因子,可以有效克服免疫排斥反应,同时 PERV感染问题也已得到解决,将多种基因修饰猪与有前景的新药理学策略相结合,可能会延长受体的生存时间。虽然目前临床异种移植尚未成功,但异种器官移植为解决人类器官供体资源匮乏的问题提供了新的可能,也为终末期肝病患者的治疗带来了一线曙光。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。