基于细胞信号通路探讨中药复方治疗冠心病研究进展※

路清越 宋耀鸿

(1.南京中医药大学2021级硕士研究生,江苏 南京 210056;2.南京中医药大学附属南京中医院心内科,江苏 南京 210022)

心血管疾病在我国乃至全球发病率和死亡率均较高[1]。据调查,在欧洲49%的女性和40%的男性死亡都与心血管疾病密切相关[2-3]。冠心病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)为心血管疾病中的高发病种,在2017年我国2.9亿心血管疾病患者中,CHD患者高达1100 万人[4],预计到 2030 年全球将有23.3亿人死于该病[5]。目前,CHD的主要致病因素有血糖异常、高脂血症、吸烟、肥胖、高血压、高尿酸、高同型半胱氨酸(Hcy)血症等[6],其病理机制较为复杂,主要与心肌细胞的能量代谢障碍、细胞自噬和凋亡等因素密切相关。其治疗主要是提高患者冠状动脉的供血速度,使患者心肌耗氧量降低,改善血管内的炎症状态,保护心肌细胞等,从而改善临床症状,但因其发病机制尚未完全清楚,临床治疗难度较大。

CHD属中医学“胸痹心痛”“厥心痛”“卒心痛”“真心痛”范畴。2008年《中药临床药理学》[7]将该病分为七大证型:心血瘀阻、痰阻心脉、寒凝心脉、气滞心胸、心气亏虚、心肾阳虚和心阴不足。临床上分别用血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤合涤痰汤、枳实薤白桂枝汤合当归四逆汤、柴胡疏肝散、保元汤、参附汤合桂枝甘草汤和天王补心丹合炙甘草汤对症加减治疗,每获良效。

目前,虽有较多文献研究证实中药复方治疗CHD可通过抗炎性因子、抗氧化、保护内皮细胞和防止心肌损伤等方面发挥效果,但对于CHD调控细胞信号通路的相关作用机制方面缺乏最新的文章综述。我们对中药复方治疗CHD的关键信号通路作用机制予以综合总结论述,进一步阐明中药复方在分子水平治疗CHD的作用机制,为发掘CHD的潜在治疗手段提供帮助。

1 CHD与细胞信号通路

1.1 核转录因子κB(NF-κB)信号通路 NF-κB是一种特殊的蛋白质,也是一种重要的转录激活因子,该蛋白通过与固定核苷酸序列结合,启动基因转录功能,在机体的免疫反应、炎症的发生和发展进程等方面发挥重要作用。在促炎方面,NF-κB信号的异常调节可诱导促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β,趋化因子趋化蛋白1、IL-8和一氧化氮合酶(iNOS)等炎症靶基因持续表达,趋化炎症细胞浸润募集,直接维持和放大局部促炎反应,从而导致组织损伤和炎症[8-9]。此外NF-κB 还能通过刺激可作为NF-κB 刺激剂的TNF-α 和 IL-1β 等细胞因子,进一步活化自身,以此放大炎性反应[9]。在心肌损伤方面,SHANG X等[10]研究表明,白藜芦醇可通过激活自噬通路磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路和抑制NF-κB信号通路及相关炎症因子对脓毒症心肌起保护作用。

1.2 PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路 PI3K/Akt/eNOS传导通路参与细胞存活、凋亡和增殖等重要生理功能。PI3K是真核细胞膜的重要组成部分,在心脏中PI3K可与胰岛素共同作用形成胰岛素/PI3K信号通路,该通路的激活可参与多种心肌细胞的生理病理过程。PI3K中 p110α可调节心肌细胞的L型Ca2+通道(LTCC),而心肌细胞的收缩又依赖于内向Ca2+电流(CIcaL)通过电压依赖性LTCC引起。若PI3K通路受到抑制则会导致胰岛素信号传导异常,进而影响心肌收缩功能引起收缩障碍[11]。Akt一方面可介导eNOS磷酸化及血管生成和舒张;另一方面可激活下游的信号分子保护心脏,通过激活Akt/eNOS信号通路调节内皮细胞增殖。此外,Akt的磷酸化可激活NF-κB,从而促进TNF-α、IL-1β等促炎因子的分泌和表达引起炎性反应[12]。因此,PI3K/Akt/eNOS信号通路在保护心肌和心肌细胞的炎性反应方面发挥重要作用。王新强等[13]研究发现,长期活化该信号通路可促进心肌细胞炎性反应和心肌纤维化。赵桂香等[14]的研究提示,通过促进PI3K/Akt信号通路下游产物eNOS的合成能对心肌细胞起到保护作用。

1.3 Toll样受体4(TLR4)信号通路 TLR4是一种重要的炎症调节因子,是先天免疫系统的一部分,可对病原体产生快速反应,当Toll样受体(TLRs)激活细胞内信号响应,就会导致促炎细胞因子TNF-α等细胞毒性物质释放,造成心肌细胞的损伤。TLR4是人体内13个TLRs中与心血管疾病联系最为紧密的一种。TLR4被激活后,分泌启动细胞因子并释放蛋白酶,心肌细胞坏死或凋亡的程度更重。此时受损的心肌相应释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热激蛋白(HSPs)和TLR4所识别的线粒体成分等几种损伤相关分子模式(DAMPs),这些DAMPs会加重心脏的炎症和心肌的损伤[15]。此外,HEISERMAN J P等[16]研究证明,TLR4的激活会导致NF-κB的激活,从而引发炎症细胞因子表达的增加和凋亡级联的激活。

1.4 Notch信号通路 Notch信号通路由Notch 1、Notch2、Notch3、Notch 4及5种配体 (Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 3和Delta-like 4)组成。该信号通路经过3次酶切发挥生物学作用[17],首先在内质网内形成成熟的Notch受体;然后与配体结合,经过整合素金属蛋白酶(ADAM)的作用释放细胞外亚单位;最终由γ分泌酶催化,胞内细胞成分释放并结合转录因子重组信号结合蛋白(RBP)-Jκ,募集组蛋白乙酰基转移酶 (P300/CBP)和共活化物,调控下游基因发挥作用。从保护心肌方面,Notch信号通路可调控血管内皮细胞功能,抑制心肌细胞的凋亡,促进血管新生[18]。从炎性反应方面,该通路又可抑制心肌细胞中的炎症因子如IL-1、IL-6、炎性细胞及巨噬细胞等表达,从而减轻炎性反应,降低心肌细胞损伤程度[18]。

1.5 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路 MAPK包括p38 MAPK(p38 protein,P38)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和氨基末端激酶(JNK)3种。MAPK信号通路经过三级酶促级联反应激活后,参与细胞的分化、迁移、分裂、增殖和凋亡,调节促炎因子的产生。目前,已有大量数据表明,p38 MAPK是肥大反应的调节因子,该因子的激活可促进初始代偿期的肥厚反应,当刺激持续存在时,逐渐开始失代偿,肥大和凋亡信号之间的失衡导致心肌细胞的凋亡。此外p38 MAPK对于CHD血管的慢性炎性反应的发生发展也发挥重要作用,主要是通过上调内皮细胞黏附分子和血管细胞黏附蛋白、增加血管平滑肌细胞毒性来促进炎症因子释放,从而引发一系列炎性反应,造成心肌损伤[19]。

2 通路间的联系

CHD发病机制复杂,各个信号通路均与心肌细胞的生长凋亡及炎性反应等息息相关,至今并未完全研究透彻。此外,我们发现各个通路之前也存在相互关系,并非独立存在。各个通路之间通过相互联系,共同作用,产生级联反应,从而影响细胞生长凋亡过程。

在动脉粥样硬化中,NF-κB和p38 MAPK信号通路可通过抑制PI3K/Akt信号通路下调促炎细胞因子,研究表明 PI3K/Akt又可能是p38 MAPK活化的抑制剂,通过抑制PI3K/Akt信号通路还可抑制血管细胞生成[20]。PI3K/Akt参与NF-κB信号的调控,激活PI3K/Akt信号通路,可促使Akt蛋白的表达进而诱发eNOS磷酸化,释放内源性一氧化氮(NO)。NO具有促进细胞内皮组织再生的作用,可引发血管舒张的功能,可减轻动脉粥样硬化的程度,减少心肌细胞的缺血坏死。同时,被活化的Akt可激活NF-κB释放多种炎症信号,相反Akt也受NF-κB通路的调控,两者形成正反馈循环。另外,在TLR通路中,髓样分化因子88(MyD88)为该通路的衔接蛋白,当该通路检测到配体出现时,可快速与MyD88衔接蛋白相结合,募集IL-1受体相关激酶传递细胞信号,此时被磷酸化的受体与连接酶形成复合物,激活NF-κB抑制剂(IκB)激酶复合物、NF-κB抑制剂(IκB)蛋白和MAPK解离,最终活化NF-κB信号通路,促使炎症因子的合成与表达,造成炎性反应[21]。武坤等[22]研究表明,NF-κB 或许是Notch1的靶点,阻断Notch1下游通路的NF-κB可降低突变的白细胞数量,对炎症因子的表达产生影响。

3 中医学对CHD的认识

CHD属中医学“胸痹心痛”范畴,《山海经》中最早提出心痛一词,《素问·痹论》中说“心痹者,脉不通”。本病总属本虚标实,痰浊、瘀血、热毒、气滞、寒凝等病邪均可致此病。陈阳等[23]通过对CHD患者常规证型分布的研究发现,临床最常见的是3种证型:心血瘀阻、痰阻心脉和心阴不足;通过对CHD中医证型分布与冠状动脉CTA相关性的研究发现,中医各证型的CHD冠状动脉狭窄程度有所差异,痰阻心脉证中冠状动脉重度狭窄占比较大,气阴两虚证则多见轻度狭窄;各个证型的CHD冠状动脉的病变支数也各有不同,其中心血瘀阻证和痰阻心脉证多见多支冠状动脉病变,而气阴两虚证则多见单支冠状动脉病变。心血瘀阻证和痰阻心脉证CHD患者冠状动脉情况更严重,心肌细胞状况较差,炎性反应可能更明显。因此,针对不同证型的CHD患者,中医可辨证论治。

4 不同证型 CHD中药复方与细胞信号通路

4.1 心血瘀阻证 此证为CHD临床最常见证型,历代医家以“瘀”为该证型的核心病理因素。《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》中云“血脉相传,壅塞不通……”。该证型患者临床上表现为胸心部多疼痛剧烈,发作时痛有定处,疼痛多以刺痛、绞痛为主,更有甚者心痛彻背,背痛彻心,痛引肩背,治疗上以活血化瘀为大法,选用血府逐瘀汤加减。刘红等[24]研究血府逐瘀汤治疗心肌缺血后再灌注损伤(I/R)大鼠,实验中对磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)的蛋白表达量进行检测,结果显示,与I/R组大鼠比较,结果显示,血府逐瘀汤组心肌细胞中的p-PI3K、p-Akt表达量明显更高,且血府逐瘀汤组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CKMB)含量减少。说明血府逐瘀汤能激活PI3K/Akt 通路,抑制心肌损伤过程中的线粒体凋亡,此观点在王小平等[25]研究中同样得到证实,作为该方君药的红花通过调控PI3K/PDK1/Akt信号通路,可下调裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved Caspase-9)及促凋亡蛋白Bax的表达,从而减少心肌细胞的凋亡。姜玉姬等[26]研究血府逐瘀汤对动脉粥样硬化含药血清TLRs及炎症因子的影响发现,血府逐瘀汤抗动脉粥样硬化主要通过抑制TLR4通路的激活,使其相应的衔接蛋白MyD88的表达受到抑制,而后抑制NF-κB通路,最终减少IL-8、TNF-α、凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1),抗细胞间黏附的分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等因子的表达。肇梦楠等[27]的研究发现MAPK1、MAPK3是存在于血府逐瘀汤中的核心基因,在动脉粥样硬化过程中,当MAPK1、MAPK3信号被抑制时,IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12等炎性因子的释放均会被抑制,炎性反应减轻,内皮细胞得到保护。

4.2 痰阻心脉证 《素问·痹论》言“心痹痛者,亦有顽痰死血”,说明痰邪是导致胸痹心痛的重要原因。临床上痰阻心脉证常表现为胸闷较重伴心痛症状,气短乏力,咯吐痰涎,形体较胖,纳呆便溏,口中黏腻,潮湿或阴雨天症状较重容易发作,苔白腻或滑,脉滑。治法通常采取豁痰泄浊之法,选用瓜蒌薤白半夏汤合涤痰汤加减治疗。孙笛洋等[28]探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗2型糖尿病合并急性心肌缺血大鼠的作用机制,发现瓜蒌薤白半夏汤干预后大鼠受损的心肌组织中PI3K、Akt、eNOS的蛋白表达较未干预组明显增多,说明瓜蒌薤白半夏汤可通过清除大鼠血浆中总自由基(T-ROS),改变氧化成分水平,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路,使大鼠受损心肌得到保护。有研究表明,瓜蒌薤白半夏汤中存在多种潜在的活化因子包括槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、柚皮素等,均对CHD动脉粥样硬化进程有潜在作用。β-谷甾醇、黄芩素、槲皮素均可调控 NF-κB 信号通路,β-谷甾醇可降低 p-NF-κB 在 HAEC 细胞中的表达,并联合黄芩素调控抗炎机制,减少细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等因子的基因表达[29-30];槲皮素可通过抑制 ICAM-1因子的表达达到抗炎作用,柚皮素可抑制凋亡蛋白Caspase-3、Bax作用,增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表达,从而抑制心肌细胞的凋亡保护受损的心肌细胞,对抗动脉粥样硬化进程[31]。另外,瓜蒌薤白汤正丁醇部位可通过上调Notch通路,抑制心肌纤维化过程中转化生长因子β1(TGF-β1)表达,从而保护心肌细胞[32]。

4.3 心阴不足证 此证临床上主要表现为心隐痛时作,伴五心烦热,潮热盗汗,咽干口燥,舌红少津,苔薄,脉细,用天王补心丹合炙甘草汤滋阴清热,养心安神。多项研究表明,天王补心丹可调控炎症因子。刘珊等[33]发现天王补心丹可通过抑制TLR4、MyD88的表达,抑制炎症介质TNF-α、IL-1的释放,降低NF-κB、Toll样受体结构域衔接蛋白(TRIF)水平。黄晓宇等[34]发现,ERK5作为MAPK家族中的大分子蛋白,在天王补心丹的作用下发生磷酸化,通过激活MEK5/ERK5/MAPK信号级联通路,激活下游的靶点因子KLF4,最终发挥抑制细胞凋亡,保护内皮细胞,防止炎症发生的作用。天王补心丹还可作用于p21活化激酶4(PAK4)抗炎因子,上调其表达,联合炙甘草汤升高P13K/Akt/mTOR磷酸化水平,从而减少炎症因子TNF-α、IL-1β、单核细胞趋化因子1(MCP-1)的释放,起到抗炎、抗氧化作用,保护心肌细胞。

4.4 气滞心胸证 此证主要表现为心胸满闷,隐痛时作,痛无定处,善太息,情志不遂时疼痛加重,伴脘腹部胀满。中医治疗选用柴胡疏肝散加减疏肝理气,活血通络。蒋春建等[35]研究表明,柴胡疏肝散可调节心肌缺血大鼠MAPK通路。MAPK家族中有一种重要的活化蛋白激酶ERK1/2,该蛋白可参与细胞分化、增殖和凋亡过程。柴胡疏肝散干预大鼠心肌缺血再灌注中,通过激活该蛋白通路,参与受损心肌的修复,反之通过抑制ERK1/2加重心肌受损大鼠心肌细胞凋亡程度,心肌纤维化和炎症程度则会扩大,导致心室重构,减少血管新生。吴若霞等[36]发现,柴胡疏肝散可能通过启动PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信号通路,降低心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡指数,心肌细胞缺血缺氧后,引发Akt磷酸化水平升高,其下游产物GSK-3β活性降低,炎症因子释放减少,进而心肌细胞得到保护。

4.5 寒凝心脉证 《金匮要略》曰“心中寒者,其人苦病心如啖蒜状,剧者心痛彻背,背痛彻心,譬如蛊注”,这表明寒凝心脉证疼痛程度较重,临床上多表现为痛如绞甚至心痛彻背,背痛彻心,受寒时自觉疼痛加重,伴冷汗淋漓,形寒肢冷,苔薄白,脉沉紧。通常选用枳实薤白桂枝汤合当归四逆汤温经散寒,活血通痹。枳实薤白桂枝汤中君药枳实含有黄酮类成分,这类化学物质可通过抑制NF-κB和MAPK信号通路来减轻炎性反应,减少促炎因子的释放[37]。厚朴中木脂素类物质可下调NF-κB 信号通路中p50 和 p65亚基的表达,五聚蛋白3(PTX3)的表达亦被抑制,心肌细胞受到保护,凋亡减少[38]。另外,运用此方治疗CHD心肌再灌注损伤时,可通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路进而激活下游的蛋白激酶G(PKG),该蛋白被激活后会调节ATP 敏感性钾通道,最终减轻再灌注心肌损伤[39]。魏慧玲等[40]研究证明,当归四逆汤可通过激活PI3K/Akt信号通路减少炎症因子TNF-α和IL-6的释放。同样,在炎性反应方面,当归四逆汤可降低TLR4、NF-κB蛋白的表达以减少TNF-α、IL-16及IL-10炎症因子在组织中的释放。亦可作用于PI3K/Akt通路,但具体在心肌细胞保护方面,暂时缺乏相关研究。

4.6 心气亏虚证 此证主要见于老年或久病患者,临床主要表现为心胸部隐痛阵作,胸闷心悸气短,动则尤甚,自觉少气懒言,乏力倦怠,面色白,汗出不固,治疗用保元汤加减补养心气。保元汤中人参、黄芪、甘草等含有诸多化学成分,与各信号通路间关系密切,包括黄酮类、皂苷类、槲皮素类、木脂素类等化学物质。黄酮类化合物中的甘草苷可通过调节MMP-9、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原水平,使MAPK和NF-κB信号通路表达被抑制,减少心肌细胞凋亡,预防心肌纤维化,同时甘草苷还可减少心肌细胞毒性释放,稳定细胞内钙稳态,调节钙循环,增强其适应性来维持心肌正常生理功能[41]。黄酮类化合物中的毛蕊异黄素可调节PI3K/Akt信号通路,通过增加H9c2细胞的活性,抑制细胞内氧化和凋亡来减少心脏毒性,保护心肌细胞。皂苷类化学成分中的黄芪甲苷可激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,通过抑制细胞氧化,促进新生细胞,减轻心肌再灌注损伤;还可下调NF-κB/NRFP3的表达,同时上调PI3K/Akt通路的表达,保护神经元,抑制氧化应激反应,下调Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达,上调抗凋亡蛋白 Bcl-2、p62表达以保护心肌细胞[42-43]。槲皮素类可抑制 p38α/MAPK信号通路来延缓心肌纤维化。在炎性反应方面,黄芪甲苷可活化T淋巴细胞和CD45磷酸酶,抑制NF-κB 通路和促炎因子的释放[44]。DU Z Y等[45]研究表明,保元汤可减少p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化,抑制ROS产生,下调NF-κB表达,减少TNF-α和 IL-6促炎因子的释放,改善心肌受损情况和心肌肥厚状态。

4.7 心肾阳虚证 此证临床上主要表现为胸闷心痛,心中悸动不安,气喘气促,动则尤甚,神情倦怠,畏寒肢冷,四肢欠温伴肢体肿胀,治疗用参附汤合桂枝甘草汤加减补益阳气,振奋心阳。参附汤中的黄酮类化合物山奈酚可通过调节NF-κB,抑制血管紧张素Ⅱ刺激的心肌细胞的炎性反应和氧化。参附汤中的谷甾醇可下调人主动脉内皮细胞中的VCAM-1的表达,该因子由TNF-α刺激产生,而后抑制NF-κB、p65 磷酸化,达到保护心肌内皮细胞、缓解CHD的作用[46]。桂枝甘草汤中桂枝和甘草配伍可减少EKR1/2的表达,达到抗缺血性心律失常目的[47]。

5 结语

中药复方在临床上治疗CHD应用较为广泛,中药复方通过激活或抑制相关细胞通路的表达或传导,来达到减少促炎因子释放,抑制炎性反应发生和心肌细胞凋亡,或促进心肌细胞新生,来达到保护心肌内皮细胞、修复受损心肌进而治疗CHD的目的。

在各种疾病中,细胞间的信号分子传递作用是疾病发生发展的基本规律,通过多重细胞信号的级联反应,达成信号应答链,对于接受的信号,不断传递或放大效应,引发机体的病理生理反应。

本文对中药复方治疗CHD的关键信号通路作用机制进行总结论述,进一步阐明中药复方在分子水平治疗CHD的作用机制。虽目前已有大量关于中药复方或单味中药治疗CHD信号通路的机制研究,但仍存在一些问题:研究的通路有集中性,缺乏全面性,主要针对PI3K/Akt/eNOS、NF-κB、MAPK等通路上,而Notch、TLR4通路等研究较缺乏[48-49]。所研究的证型及中药复方同样具有集中性,对于心血瘀阻证、痰阻心脉证研究较多,而对心肾阳虚证等则相关研究较少,临床常见老年CHD患者心肾阳虚证,十分具有临床研究价值。CHD的发病机制目前尚未完全明确,且中药复方涉及的信号通路多是多个信号通路共同作用的结果,但目前研究多针对单一通路[50-51]。因此,针对以上问题,今后还需继续完善研究,以更全面地指导CHD的临床治疗。