两种组胺受体拮抗剂对HP-PRRS猪肺脏PRRSV核酸拷贝数的影响

刘芳 高登慧 欧德渊 万文华

关键词：PKRS;组胺;肺脏病毒核酸拷贝数测定

猪蓝耳病（PRSS），又称猪流行性流产呼吸综合症，主要表现在仔猪呼吸困难和母猪繁殖障碍两个典型症状，PRRSV主要侵害猪的呼吸系统，肺脏发生典型的间质性肺炎。现今，用于检测PRRSV的方法较多，其中，实时荧光定量PCR方法能测定病毒含量和区分因污染引起的假阳性，且较普通PCR方法灵敏度高，具有较好的稳定性和可重复性，操作方法简便，同时，也减少了核酸对环境的污染，适用于样品的大批量检测，便于客观分析各实验组病毒含量的差异性，减少了由于实验操作或环境条件变化等导致的误差，使HP-PRRS患猪的肺脏病毒含量检测简便易行，且敏感度和稳定性高。

组胺是机体不可忽略的炎性因子之一，现已证实肺脏组胺受体主要是H1R和H2R，组胺能通过H1R和H2R间的相互作用，使肺微血管的通透性增加，导致肺脏微循环紊乱和病理损伤。本实验采用荧光定量PCR法检测各组仔猪肺部病毒核酸拷贝数，进一步探讨两种组胺受体拮抗剂对HP-PRRS患猪肺炎的影响，为防治该病奠定了一定的理论基础。

一、材料

高致病性蓝耳病病毒为贵州分离株GZKB株，由贵州省动物疫病研究室惠赠;荧光定量试剂盒，购自大连宝生物公司;Line-Gene荧光PCR仪（BYQ6009-107B），杭州博日科技有限公司;酶标仪（AC100-120），澳大利亚。

二、方法

（一）分组处理

30日龄三元杂交公仔猪20头购自贵州省贵阳市某养猪场，仔猪均未注射蓝耳病疫苗，体重为8.9～11kg，随机分为阴性对照组、阳性对照组、扑尔敏组和西咪替丁组，每组5头。其中，扑尔敏组、西咪替丁组、阳性组仔猪同一天肌肉注射PRRSV（10CIDso）2mL/头，并于感染病毒前1天开始，每组每天分别肌肉注射扑尔敏1.5mL/d头、西咪替丁1.5mL/头、生理盐水2mL/头，阴性对照组仔猪为每日早晚肌肉注射生理盐水2mL/头。

（二）样本处理

颈静脉放血处死人工感染病毒第10d的各组仔猪，取新鲜肺样立即放于液氮中，定量称取肺样，经定量DEPC水研磨，冷冻离心，弃沉淀留上清，用于病毒核酸拷贝数的测定。

（三）荧光定量标准曲线建立

1、标准质粒制备。用紫外分光光度计分别检测贵州省动物疫病研究室惠赠的PRRSV N基因克隆标准质粒OD和0D，计算质粒DNA溶液的浓度，同时，按照10逐级梯度稀释，梯度浓度，作为已知含量的标准模板，用于优化本实验中荧光定量PCR的反应体系和条件，建立标准曲线和检测样品核酸拷贝数。

2、实时荧光定量PCR反应条件优化。首先进行引物合成。以制备的标准品作为模板，进行SYBR Green-I实时荧光定量PCR扩增，优化反应体系中的引物浓度、退火温度等条件，最终确定该方法的最佳反应体系和条件。PCR反应体系为（需在冰上加样，总量：25μL）：

3、特异性、重复性检测及标准曲线的建立。待荧光定量PCR反应条件优化好，以PRRSV N基因标准质粒为模板，进行敏感性、重复性检测，以CSF、PPV、JEV、SIV为对照，进行特异性检测，特异性条件成立后建立标准曲线。

（四）肺脏病毒核酸拷贝数测定

肺样病毒核酸反转录：与实验一的反转录方法相同，取制备好的肺样上清，以P1、P2为引物，反转录各肺样病毒RNA为cDNA。

拷贝数测定：以cDNA为模板，设立对照组，采用与建立标准曲线相同的反应条件和体系进行实时荧光定量PCR，用标准曲线计算各样品PRRSV拷贝数。

三、结果

（一）实时荧光定量PCR标准曲线的建立

l、PRRSV N基因实时荧光定量PCR反应条件的优化。取由贵州省动物疫病研究室惠赠的含PRRSV N基因的标准质粒进行实时荧光定量PCR条件优化，经优化的循环体系为：95℃预变性30s;95℃变性5s，5CC退火40s，72℃延伸50s，85℃解链引物二聚体10s，40个循环;最后72℃再延伸10rain，台阶温度为0.5℃;95℃15s，溶解曲线。

2、PRRSV N基因实时荧光定量PCR重复性、特异性检测。选择标准质粒浓度为1.0x106/μL、1.0x107/μL、1.0x10s/μL、1.0x10/μL为模板，每个浓度重复设5个样品，结果表明，相同浓度的S型扩增曲线峰值相似度高，说明N基因引物重复性好。采用相同方法检测PRRSV N基因的特异性，除PRRSV N基因能扩增出S型曲线外，对照组均未扩增出S型曲线，说明本实验建立的PRRSV N基因实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性。

3、PRRSV N基因实时荧光定量PCR标准曲线的建立。将含PRRSV N基因的标准质粒倍比稀释，采用每微升含拷贝数为1.0x10～1.0x10的模板量制定的标准曲线，线性关系较好，且相关系数为-0.997，试验数据误差小，结果见图1。

（二）仔猪肺脏PRRSV拷贝数的测定

采用实时荧光定量PCR的方法测定肺脏PRRSV拷贝数，其中阳性组含量最高，扑尔敏组、西咪替丁组显著低于阳性组（P<0.05），扑尔敏组含量最低，西咪替丁组与扑尔敏组差异不显著，结果见表1。

四、讨论

（一）关于PRRSV N基因荧光定量PCR标准曲线的建立

实时荧光定量PCR中标准曲线的制作和扩增曲线与实验结果的可靠性密切相关。本实验选用了与样品结构相似的含PRRSV N基因的标准质粒，使样品扩增效率与标准品较为接近，且本实验中标准曲线的相关系数值为0.997，较接近1，定量较准确。实时荧光定量PCR中的扩增曲线呈s型，由于反应体系中各种物质的消耗等原因，扩增曲线最终进入平台期，本实验中各组仔猪肺脏PRRSV N基因的扩增曲线指数增长期的区域重复性较好，且经优化的PRRSV N基因的荧光定量PCR方法特异性、重复性、对照性等均成立，表明使用该方法所检测的结果较准确、误差小。

（二）组胺拮抗剂对HP-PRRS患猪病毒核酸拷贝数的影响

PRRSV在猪体内分布较广，增殖速度较快，人工感染PRRSV仔猪的第2天，能在血液中检测到PRRSV，在攻毒后第10天左右增殖量最大。采用荧光定量RT-PCR法研究得出，PRRSV分布于猪的多种脏器中，其中，扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高，肝、脾脏、肺次之，脑组织中也能检测到病毒;人工感染PRRSV在体内的分布量与检测时间、攻毒量、猪体抵抗力等相关，本实验检测人工感染PRRSV第10天仔猪肺脏病毒核酸拷贝数，阳性组肺脏PRRSV核酸拷贝数范围与孟韩冰（2009）、方桂友（2009）等的检测结果较相似，但实验组中的扑尔敏组、西咪替丁组显著较低。

组胺通过与相应的受体结合，介导不同的病理生理作用。血管组胺受体主要为H1R和H2R，肺脏组胺受体主要也是H1R和H2R，而组胺H1R具有介导炎症反应的作用。本实验每日注射组胺H1R和H2R拮抗剂扑尔敏和西咪替丁后，发现阳性组仔猪肺脏病毒含量较实验组显著最高，扑尔敏组含量最低，且撲尔敏组肺脏损伤最轻，病理学评分均较西咪替丁、阳性组低，说明组胺H1R受体拮抗剂能拮抗炎症反应，调节机体免疫功能，减轻肺脏损伤，缓解仔猪病情，可能具有抗病毒能力。