磷酸三(2,3-二氯丙基)酯和纳米二氧化钛联合暴露诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡

赵雪松,王琬玥,黄嘉诚,武 韬,赵 岩,任 新*

(1.吉林师范大学 工程学院,吉林 四平 136000;2.四平市生态环境局 生态环境监测中心,吉林 四平 136000)

0 引言

在复杂的水环境体系中,任何一种污染物都不会以单独的方式入侵生物体,其物化特性、分散程度以及与其他污染物的共存都会影响污染物对生物体的毒性效应,因此,进行复合污染的毒性效应研究对于真实水环境生态安全评估具有长远的影响.纳米TiO2(nano-TiO2)是目前应用范围最为广泛的人工纳米材料(MNMs)之一,环境中的残留浓度较高,容易被生物体摄入.毒理学研究显示,MNMs不仅自身有毒,还与环境中的共存污染物发生吸附等相互作用,从而影响这些污染物在环境中的环境行为,改变生物对其利用性,最终产生无法预料的联合生物效应[1-3].磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)是一种广泛应用的有机磷酸酯阻燃剂(OPFRs),近些年,TDCIPP作为多溴联苯醚的理想替代品被广泛地使用,且在使用过程中TDCIPP是以简单的物理方式进行添加,使其极易释放到水体、土壤与沉积物、大气及生物体等几乎所有的环境介质中[4-6].鉴于MNMs特殊的理化性质——粒径小、比表面积大,nano-TiO2会影响共存污染物TDCIPP的环境行为,进而改变其生物利用性和生物毒性,二者共存所带来的新的环境风险是事实存在且值得关注的问题.同时已经有研究证实,nano-TiO2会抑制TDCIPP的毒性,但是仍会对斑马鱼幼鱼造成氧化损伤[7].

本文将通过观察TDCIPP与nano-TiO2单一与共同暴露组的AO染色,测定细胞率以及凋亡酶Caspase-3和Caspase-9与凋亡基因p53与Bax的基因表达,评估复合暴露诱导的细胞凋亡,并通过对比TDCIPP单一暴露与复合暴露凋亡效果的差异,评价nano-TiO2对TDCIPP诱导细胞凋亡的影响.

1 实验

1.1 试剂

TDCIPP购自Sigma公司,纯度为分析纯;nano-TiO2购自深圳纳米巷有限公司,用培养液稀释为1 mg/L;二甲基亚砜(DMSO)、NaHCO3、KCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O 均购于国药集团化学试剂有限公司,纯度为分析纯.

选择培养液(64.75 mg/L NaHCO3,5.75 mg/L KCl,123.25 mg/L MgSO4·7H2O,294 mg/L CaCl2·2H2O)制备暴露溶液,用二甲基亚砜(DMSO)将暴露溶液的浓度分别稀释为5、20、80、180 μg/L.

1.2 暴露实验

在解剖镜下挑选囊胚期的胚胎进行暴露实验.实验设置空白对照组;DMSO对照组;5、20、80、180 μg/L TDCIPP单一暴露组;1 mg/L nano-TiO2单一暴露组;5 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2、20 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2、80 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2、180 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2复合暴露组.每个暴露组随机放置300～400颗胚胎,每个暴露浓度设置三组平行实验.胚胎暴露时间为96 h,暴露期间每天更换50%的暴露液,并剔除死亡胚胎.

1.3 细胞凋亡染色

吖啶橙(AO)是一种对研究细胞凋亡模式有效的核酸选择性异染染色剂.96 hpf孵化出的鱼苗挑选20条,在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次后转移到包含PBS的5 μg/mL AO溶液中进行暴露,在室温下染色10 min,然后在同一缓冲液中洗涤两次,每次洗涤3 min.每个胚胎染色后立即用荧光显微镜拍照.

1.4 细胞凋亡酶测定

96 h后,从所有浓度的培养皿中随机选出幼鱼80条,分别放入磷酸缓冲生理盐水中清洗掉杂质.Caspase-3与Caspase-9均依照生物试剂盒的说明书规范操作,具体操作方法见参考文献[7].

1.5 细胞凋亡基因表达的测定

样品RNA的提取,cDNA合成,荧光定量PCR的方法见参考文献[7],测定p53与Bax凋亡基因,β-actin基因作为内参,引物序列见表1.

表1 基因引物序列

2 结果与讨论

2.1 TDCIPP与nano-TiO2复合诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡

96 h后,在每个培养皿中共取出100个胚胎,其中20个用于吖啶橙染色观察细胞凋亡区域,80个用于细胞凋亡酶活性的测定.实验结果可以看出,空白对照组暴露96 h后,胚胎孵化成为幼鱼.空白对照组以及nano-TiO2对照组,幼鱼几乎没有凋亡的区域.单一TDCIPP暴露时,随着暴露浓度的增加,凋亡细胞增加.与单一TDCIPP暴露组相比,TDCIPP与nano-TiO2复合暴露组幼鱼细胞凋亡率降低.此研究结果与前期进行的多壁碳纳米管降低多溴联苯醚对斑马鱼胚胎毒性的结果一致[8],主要原因是nano-TiO2强烈的吸附作用,能够吸附水中共存的污染物,降低其游离的浓度,进而降低了对生物的毒性.

(A) 空白对照;(B) 1 mg/L nano-TiO2;(C) 5 μg/L TDCIPP;(D) 5μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2;(E) 20 μg/L TDCIPP;(F) 20 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2;(G) 80 μg/L TDCIPP;(H) 80 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2;(I) 180 μg/L TDCIPP;(J) 180 μg/L TDCIPP+1 mg/L nano-TiO2

2.2 TDCIPP与nano-TiO2复合对斑马鱼胚胎细胞凋亡酶的影响

由图2可知,TDCIPP单一作用与联合暴露的Caspase-3上调.其中TDCIPP单独处理组与对照组相比分别显著增加了56%、165%、205%和257%,联合暴露组20 μg/L+1 mg/L、80 μg/L+1 mg/L和180 μg/L+1 mg/L的Caspase-3酶活性也上升了28%、132%和166%.但是相对于单一处理组增加值均有所减少,分别减少了137%、73%、91%,且复合处理组中TDCIPP与nano-TiO2相对于单一处理组的增加值均有所减少.

图2 TDCIPP与nano-TiO2复合暴露胚胎96 hpf后Caspase-3(A)与Caspase-9(B)活性变化

TDCIPP单一作用与复合暴露的Caspase-9也上调,其中TDCIPP单独处理组与对照组相比分别显著增加了166%、242%、337%和401%,5 μg/L+1 mg/L、20 μg/L+1mg/L、80 μg/L+1mg/L和180 μg/L+1 mg/L这四个复合暴露组Caspase-9活性也显著增加了86%、158%、205%和340%.但是相对于单一处理组的增加值均有所减少,分别减少了80%、84%、132%和61%.Caspase 3是Caspase家族的细胞凋亡激活酶[9],在细胞凋亡的建立中起重要作用.在单一暴露组中,Caspase 3和Caspase 9的活性显著增加且存在剂量依赖关系,表明纳米TDCIPP激活Caspase 3导致斑马鱼幼鱼发生细胞凋亡.复合暴露组中Caspase 3和Caspase 9的活性小于TDCIPP单独暴露,造成TDCIPP毒性降低的原因除了nano-TiO2对其吸附造成溶液中游离的TDCIPP浓度降低以外,通过细胞膜进入体内的nano-TiO2对斑马鱼细胞凋亡酶也可能存在影响,且与TDCIPP存在拮抗效应.

2.3 TDCIPP与nano-TiO2复合对斑马鱼胚胎凋亡基因的影响

图3表明,TDCIPP单一暴露p53上调,复合暴露组基因表达也一样.其中TDCIPP单独暴露与空白组相比分别增加了0.89、1.64、2.12、2.61倍,5 μg/L+1 mg/L、20 μg/L+1 mg/L、80 μg/L+1 mg/L和180 μg/L+1 mg/L这四组p53基因表达也增加了0.46、1.26、1.56、2.02倍.但是相对于单一处理组的增加值均有所减少,分别减少了0.43、0.38、0.56、0.59倍.Bax的基因表达在TDCIPP和nano-TiO2单一与联合暴露组中均上调,其中TDCIPP单独处理组与对照组相比分别显著增加了1.54、2.12、3.41、3.57倍.p53蛋白是细胞凋亡的重要调节因子,在细胞凋亡过程中,p53转移到细胞核并诱导线粒体膜中促凋亡基因(如Bax)的转录.通过这种方式,细胞凋亡指标Caspase 3被激活,细胞死亡加速[10].结果表明,斑马鱼胚胎暴露于TDCIPP增加了细胞内的活性氧产生,Caspase-3活性p53和Bax蛋白表达增加.由此可推断,TDCIPP诱导的斑马鱼幼虫凋亡可能通过活性氧产生激活p53表达的途径,Bax和Caspase-3的激活随后被触发,细胞内部启动凋亡程序,进而发生细胞凋亡.nano-TiO2与TDCIPP联合暴露组,p53与Bax表达降低,进一步从基因层面证实nano-TiO2能降低TDCIPP急性暴露对斑马鱼细胞凋亡的诱导.然而,随着暴露时间的延长,MNMs对其他共存物质毒性影响的结果也不会发生变化.J.J.Fu等[11]研究发现,斑马鱼胚胎全生命周期复合暴露nano-TiO2与双酚A后,nano-TiO2能够显著增加双酚A在母体的积累,并加剧双酚A对子代的神经毒性.可见,MNMs与污染物联合作用的时间不同会导致不同的毒性作用形式,毒性作用机制的揭示还需进一步的实验支撑.

图3 TDCIPP与nano-TiO2复合暴露96 hpf后斑马鱼胚胎基因表达p53(A)与Bax(B)

3 结论

(1) TDCIPP的暴露使Caspase-3、Caspase-9凋亡酶的水平升高,这是由于TDCIPP进入细胞后,污染物的释放产生凋亡复合体激活Caspase-9,激活的Caspase-9通过激活Caspase-3导致细胞发生凋亡.而nano-TiO2的加入减少了游离的TDCIPP进入斑马鱼胚胎,降低了Caspase-3、Caspase-9酶水平的升高幅度.

(2) TDCIPP与nano-TiO2的暴露使p53、Bax基因表达上调.污染物TDCIPP与nano-TiO2导致在斑马鱼胚胎中的凋亡是通过诱导ROS产生而发生的,该过程从激活p53开始,然后转录编码促凋亡蛋白的基因.通过参与斑马鱼胚胎中p53依赖通路而诱导氧化应激和凋亡,而nano-TiO2的加入减少了游离的TDCIPP进入斑马鱼胚胎,减少了p53、Bax基因表达上调.