仿胶原纤维屈曲结构PPDO纤维膜的制备及性能

魏 岑，魏乐倩，李超婧，毛吉富，王 璐

(东华大学 a.纺织学院, b.纺织面料技术教育部重点实验室, 上海 201620)

胶原纤维以平行束的形式存在于人体多个部位的细胞外基质(ECM)中,通常呈卷曲的周期性波浪形态[1]。这种屈曲结构ECM能够为瓣膜小叶、韧带和肌腱等组织提供弹性以防止损伤,有助于改善组织的非线性力学性能。除纤维间的相互作用以外,随着应变的增加,波纹逐渐展开,组织刚度增加[2],这种应变加固效应能够在低应变下提供柔韧性,防止过载和损伤,增加延伸性[1]。

静电纺丝技术被广泛应用于组织工程,如利用微纳米纤维结构来模拟天然ECM的纤维微环境。此外,利用静电丝技术制备平行取向排列的微纳米纤维,可用于模仿部分天然组织的高度各向异性结构[3]。探索静电纺丝微纳米纤维屈曲结构的制备方法成为当前的研究热点。通过获得卷曲结构从而提高纤维膜的力学性能可制备既具有优异的生物相容性又能满足天然组织力学需求的组织工程支架[4],现有的制备方法分为直接电纺卷曲纤维膜以及对电纺膜进行后处理两种方式[5]。目前大部分用于进行组织再生的卷曲电纺纤维膜是通过后处理技术获得的,例如:Surrao等[6]和Szczesny等[7]先将聚合物电纺到旋转的芯棒上以获得取向纤维,再将其浸泡于37 ℃的缓冲溶液中进行后处理以赋予纤维卷曲形态,细胞试验结果表明该支架有助于韧带组织的再生和重塑;Liu等[3]利用聚合物和增塑剂之间的相互作用,获得卷曲程度可控的电纺聚乳酸纳米纤维,结果显示,在卷曲的纳米纤维上培养的肌腱成纤维细胞能够对外界压力表现出更高的耐受性,即电纺卷曲的聚乳酸纳米纤维可用于修复结缔组织。由此可见,卷曲结构的特性能够对用于修复韧带、肌腱等致密结缔组织的纤维支架产生有效影响。

聚对二氧环己酮(PPDO)是一种脂肪族聚酯材料,其分子链中的酯键使该材料具有良好的生物相容性、生物降解性和可吸收性[8-9],能够在体内完全降解,且降解产物无毒副作用[10-11],相比降解后产生酸性产物引起炎症反应的聚乳酸而言具有更好的生物相容性;此外,PPDO分子链中含有独特的醚键,使得材料具备了优异的柔韧性和抗拉强度[12-13]。本研究在此基础上对PPDO电纺纤维膜进行天然胶原纤维屈曲结构的仿生处理,以提高其拉伸弹性,改善其亲水性;同时,探究其应用于组织工程再生的可能性。采用热处理的方法使静电纺PPDO微纳米纤维获得波纹形屈曲结构;为避免因电纺纤维膜中的纤维排列过于紧密而限制细胞向膜内渗透和生长[14],利用硼氢化钠(NaBH4)与甲醇(CH3OH)之间的化学反应生成氢气气泡将纤维吹散,以增加纤维间的孔隙,从而对屈曲的PPDO微纳米纤维膜进行蓬松处理,获得仿胶原纤维屈曲结构的PPDO纤维膜,并对PPDO纤维膜的各项性能进行表征,探讨此工艺模拟ECM胶原屈曲形态的可行性。

1 试验部分

1.1 试验材料与仪器

PPDO,东莞市凯茜利塑胶原料有限公司;六氟异丙醇(HFIP),上海市阿拉丁试剂有限公司;乙醇(C2H5OH)、NaBH4、CH3OH,国药集团化学试剂有限公司;人包皮成纤维细胞(HFF-1)、完全培养基,中国科学院上海细胞库;细胞计数试剂盒(CCK-8),上海圣尔生物科技有限公司;磷酸缓冲盐溶液(PBS)1X,美国Thermo公司。

ME204E型电子天平,瑞士METTLER TOLEDO;524 G型磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;ET-2535 H型静电纺丝装置,永康乐业科技发展有限公司;SU8010型场发射扫描电子显微镜,日本日立公司;D8 ADVANCE型X射线衍射仪,德国Bruker 公司;Autosorb-iQ型全自动快速比表面与孔隙度分析仪,美国康塔仪器公司;OCA15EC型接触角测量仪,德国dataphysics公司;HY-940FS型电脑式拉压力试验机,上海恒驭仪器有限公司;Multiskan FC型酶标仪,美国Thermo公司。

1.2 PPDO纤维膜的制备

称取一定质量PPDO颗粒溶解于HFIP中,用磁力搅拌器在室温下搅拌12 h,配制PPDO质量分数为17%的纺丝溶液。静电纺丝选用规格为22 G的针头,纺丝电压为24 kV,接收距离为18 cm,注射器推注速度为2 mL/h,承接滚轴转速为1 800 r/min,环境参数为温度20～30 ℃,相对湿度50%～60%。纺丝完成后,将所得的纤维膜置于通风橱中,在室温下干燥24 h以去除残留溶剂。

1.3 仿胶原纤维屈曲结构的制备

在恒温水浴锅中将无水乙醇溶液加热至35 ℃并保持温度恒定,将裁剪好的PPDO纤维膜浸泡在热的无水乙醇溶液中,30 min后取出静置干燥。称取硼氢化钠粉末并将其溶解于甲醇溶液中,配置成浓度为0.1 mol/L的硼氢化钠-甲醇溶液,将裁剪好的PPDO纤维膜置于上述溶液中,待反应结束后取出纤维膜并置于通风橱中干燥。

1.4 理化性能测试与表征

1.4.1 微观形貌

使用SU8010型场发射扫描电子显微镜(SEM)观察各仿生层支架的微观形态。采用Image J软件测试纤维直径、纤维排列的取向程度、卷曲波纹形纤维中波纹的振幅和波纹的长度。其中:用纤维排列的角度表征纤维排列的取向程度;通过测量卷曲纤维中一个波纹内波峰位置和波谷位置的高度差表征波纹振幅;用卷曲纤维中一个波纹内波峰位置与波谷位置间距的两倍表征波纹的波长。每种样品测试100组,结果取平均值。

1.4.2 结晶度测试

采用D8 ADVANCE型X射线衍射(XRD)仪测试PPDO纤维膜的结晶度。设定衍射角扫描范围为5°～60°。根据结晶峰计算样品的结晶度。

1.4.3 比表面积及孔隙分布

称取400～500 mg PPDO纤维膜,在40 ℃条件下真空脱气处理10 h;使用Autosorb-iQ型全自动快速比表面与孔隙度分析仪,采用氮气吸附法在液氮温度77 K的环境下对PPDO纤维膜的比表面积及孔隙分布进行测量。

1.4.4 水接触角

采用OCA15EC型接触角测量仪测试PPDO纤维膜的静态水接触角。将体积为5 μL的去离子水滴至材料表面,通过悬液法测定样品表面的静态水接触角,每个样品测试5个不同位置的水接触角,结果取平均值。

1.4.5 力学性能

使用HY-940FS型电脑式拉压力试验机,参照GB/T 3923.1—2013《纺织品 织物拉伸性能 第1部分:断裂强力和断裂伸长率的测定(条样法)》[15]对PPDO纤维膜进行单轴拉伸测试。将纤维膜分别沿横向和纵向裁剪成尺寸为10 mm×70 mm的条形试样,用台式测厚仪测量纤维膜的厚度,设定标距为50 mm。当条形试样的夹持方向平行于受力方向时,以100 mm/min的速度拉伸试样至样品断裂,根据拉伸应力-应变曲线计算不同PPDO纤维膜的拉伸强度、断裂伸长率及弹性模量,每组测试5个样品,结果取平均值。

1.5 生物性能评价

1.5.1 细胞增殖

样品准备:样品用去离子水浸泡48 h,干燥后裁剪成直径为1.5 cm的圆片并置于24孔细胞培养板内。样品使用前在乙醇体积分数为75%的酒精蒸缸中处理24 h,取出后用PBS溶液浸泡12 h,再更换新的无菌PBS溶液浸泡6 h并重复一次,细胞接种前用无菌PBS溶液清洗试样两次,去除样品中残留的乙醇。

细胞接种与培养:复苏HFF-1第25代,于温度37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养至细胞密度达90%。使用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶将细胞从培养瓶中消化下来并转移至离心管中。离心后得到细胞沉淀物,加入1 mL完全培养基制得细胞悬浮液;取10 μL上述悬浮液,用无菌PBS溶液稀释至100 μL,统计稀释细胞悬液中的细胞数量以确定细胞密度,计数后配制细胞密度为4×104个/mL的细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液以500 μL/孔的含量加入24孔培养板中,每2 d更换一次细胞培养液。

细胞增殖曲线:细胞培养1 d后,取出24孔培养板,移除培养孔内样品,并吸去细胞培养孔内培养基,使用无菌PBS溶液洗去孔内残余液体;配制由90% 高糖的氨基酸葡萄糖培养基(DMEM)和10% CCK-8试剂混合而成的CCK-8工作液,并将上述溶液加至500 μL/孔的培养板中,在培养箱中于标准试验条件下孵育3 h。孵育结束后将溶液转移至96孔板,在酶标仪中测量其在波长450 nm处的吸光度。细胞增殖率Rcell计算方法如下:

(1)

式中:Dt为所测样品的吸光度值;D0为空板吸光度值;Dc为空白对照组的吸光度值。

根据计算所得的细胞增殖率按表1进行细胞毒性分级评定,其中毒性反应级别在Ⅰ级以下时可判定为材料无细胞毒性。

表1 细胞毒性评级标准[16]Table 1 Cytotoxicity rating criteria[16]

1.5.2 免疫荧光染色

使用鬼笔环肽和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对显绿色的纤维形肌动蛋白(F-Actin)和显蓝色的细胞核进行荧光标记。具体步骤:配制1%牛血清白蛋白(BSA)溶液,0.5%聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100),100 nmol/L异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽(FITC Phalloidin)工作液,100 nmol/L DAPI工作液;取出培养板后吸去培养液,用37 ℃预热的PBS(pH=7.4)溶液清洗细胞2次;用4%多聚甲醛室温固定10 min,随后用PBS溶液清洗细胞10 min(重复3次);用0.5% Triton X-100室温透化20 min,随后用PBS溶液清洗细胞10 min(重复2次);每孔加入200 μL 100 nmol/L的FITC Phalloidin工作液,室温避光孵育30 min;孵育结束后,PBS溶液清洗5 min(重复3次),每孔加入200 μL 100 nmol/L的DAPI工作液,室温避光孵育5 min;吸去染色液后用PBS溶液清洗,留少许PBS溶液湿润样品,在荧光显微镜下观察试样。

1.6 统计学分析

本文数据均以平均值±标准差形式表示。采用单因素方差分析比较各组结果之间的差异。当p<0.05时,差异显著,用*表示;当p<0.01时,差异非常显著,用**表示。

2 结果与讨论

2.1 微观形貌分析

纤维表面的几何形貌能够直观反映处理前后材料表面发生的细微变化。对未处理的PPDO取向纤维膜(PPDO-O)、蓬松处理后的蓬松PPDO纤维膜(PPDO-F)、卷曲处理后的卷曲PPDO纤维膜(PPDO-W)以及卷曲处理后再进行蓬松处理的卷曲蓬松PPDO纤维膜(PPDO-W-F)的表观形貌进行观察,并对纤维进行表面几何形貌分析,结果如图1～4所示。

图1 PPDO取向纤维膜的SEM图及表面几何形貌信息图Fig.1 SEM image and surface geometry information images of PPDO oriented fiber membrane

图3 卷曲PPDO纤维膜的SEM图及表面几何形貌信息图Fig.3 SEM image and surface geometry information images of wavy PPDO fiber membrane

由图1～4可知:取向纤维膜PPDO-O中的纤维排列取向程度较高,纤维直径为(0.488±0.366)μm。蓬松处理后PPDO纤维膜的纤维直径为(0.574±0.427)μm,纤维排列的取向程度略有降低且排列较为松散,纤维膜截面SEM图显示纤维层间出现明显的分层现象。卷曲处理后PPDO纤维膜的纤维沿取向方向产生了类似天然胶原纤维的波纹形屈曲结构,波纹振幅为(4.464±1.236)μm,单个波纹的周期性长度为(38.725±9.689)μm。卷曲的PPDO纤维膜再进行蓬松处理后所得的纤维的屈曲结构仍稳定存在且纤维排列更为松散,纤维层间仍存在明显的分层现象。对比4种PPDO纤维膜的微观形貌可知,研究中采用的卷曲处理和蓬松处理方法不仅能使PPDO取向纤维膜产生仿胶原纤维屈曲结构的波纹形纤维,而且能够对紧密排列的电纺纤维产生一定的分散作用,使得纤维结构更为疏松。

2.2 结晶度分析

对不同PPDO纤维膜进行XRD测试,结果如图5所示。由图5可知,PPDO纤维膜的衍射角在21°和24°处均出现了结晶峰,且结晶峰的峰强存在明显差异,说明卷曲处理和蓬松处理会对PPDO纤维的结晶情况产生显著影响。

通过分峰处理,计算得出不同PPDO纤维膜的结晶度,如图6所示。由图6可知,PPDO取向纤维膜结晶度为(46.96±1.25)%,卷曲处理后纤维膜结晶度减小为(40.34±0.34)%,蓬松处理后纤维膜降低为(43.13±0.32)%,卷曲-蓬松处理后纤维膜结晶度下降至(40.95±1.07)%,说明蓬松处理和卷曲处理显著降低了纤维膜的结晶度。这可能是因为取向纤维膜成型过程中的取向牵伸使得PPDO的分子链链段沿牵伸方向取向排列并形成结晶结构,将其浸泡于乙醇或甲醇溶液后,PPDO晶态结构中取向排列的分子链链段逐渐舒展并解取向,温度升高至35 ℃会对分子链链段的解取向产生热定型作用从而使纤维呈现波纹形态,纤维的结晶区随着分子链链段的解取向逐渐转变为非结晶区,因此处理后PPDO纤维膜的结晶度明显降低。

图6 不同PPDO纤维膜的结晶度Fig.6 Crystallinity of different PPDO fiber membranes

2.3 比表面积及孔隙体积分析

比表面积对微纳米材料而言具有重要意义,材料的比表面积越大,其所具有的表面能越大,材料表面的接触位点也就越多。对不同PPDO纤维膜的比表面积和孔隙体积进行测试,结果如图7和表2所示。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)在2015年更新的物理吸附等温线的分类可知,图7中PPDO纤维膜的测试曲线趋势呈典型的Ⅱ型等温线特征[17]。这是因为PPDO纤维膜表面具有较强的相互作用,在相对较低的压力下吸附量迅速增加,表现为曲线斜率较大;随着相对压力的增大,单层吸附逐渐饱和,从而转变为多层吸附;从图7可以看出,相对压力趋向1时,卷曲、蓬松处理后的纤维膜的吸附量明显高于未处理的PPDO取向纤维膜,说明处理后纤维膜中可吸附气体的位点明显增多。

表2 不同PPDO纤维膜的比表面积和总孔隙体积

由表2可知,PPDO取向纤维膜的比表面积为4.094 m2/g,孔隙体积为1.31×10-2cm3/g;蓬松处理后纤维膜的比表面积减小至3.740 m2/g,而孔隙体积增至1.72×10-2cm3/g,说明蓬松处理对纤维排列有一定的分散作用,可使部分纤维团聚成簇的同时各簇纤维间出现间隙;卷曲处理后纤维膜的比表面积增至5.875 m2/g,孔隙体积也略有增加,说明卷曲处理赋予纤维膜的屈曲结构能够使纤维膜的比表面积增大;蓬松卷曲PPDO纤维膜的比表面积增至5.112 m2/g,孔隙体积显著增至2.19×10-2cm3/g,说明卷曲处理和蓬松处理能够对纤维的分散产生协同作用,同时能够增大纤维膜的比表面积和孔隙体积,有利于细胞的黏附和生长。

2.4 水接触角分析

接触角是衡量材料表面对液体的润湿性能的重要参数,常用于表征纤维膜表面的亲疏水性,若接触角小于90°,则材料表面呈亲水性,反之,材料表面呈疏水性。研究[18]表明,改善材料表面的亲水性能够促进细胞的黏附和迁移。本研究使用超纯水对不同PPDO纤维膜的水接触角进行测试,结果如图8所示。

图8 不同PPDO纤维膜的水接触角Fig.8 Water contact angle of different PPDO fiber membranes

PPDO取向纤维膜的水接触角为(125.26±2.33)°,说明PPDO取向纤维膜表面疏水;蓬松处理后纤维膜的水接触角减小至(84.72±10.65)°,纤维膜表面的亲水性明显提高,这是因为蓬松处理使得纤维间隙增加且纤维层间发生分层,纤维膜内储存水的孔隙增大,促进纤维膜表面对水的润湿作用;卷曲处理后纤维膜的水接触角为(127.07±2.01)°,相比取向纤维膜未发生明显改变,说明卷曲处理并未明显改变纤维膜的亲疏水性。在卷曲处理的基础上进行蓬松处理所得的纤维膜表面的水接触角为(93.16±7.06)°,说明同时经过卷曲处理和蓬松处理的PPDO纤维膜的亲水性有明显提高。

2.5 力学性能测试

植入体内的材料通常对力学性能都有一定的要求,需要材料与植入部位的力学需求相匹配,电纺膜材料的力学性能主要取决于纤维的结构以及材料本身的力学性能。对不同PPDO纤维膜分别进行纵向和横向拉伸性能测试,其中,横向拉伸是指拉伸方向垂直于纤维原有的取向方向,纵向拉伸则是指拉伸方向平行于纤维原有的取向方向,结果如图9和10所示。由图9和10可知,4种PPDO取向纤维膜均表现出明显的力学各向异性。

图9 不同PPDO纤维膜纵向拉伸测试结果Fig.9 Tensile results of different PPDO fiber membranes in vertical direction

由图9可知:蓬松处理对纤维膜纵向拉伸性能未产生明显影响;卷曲处理对纵向拉伸强度的影响不显著,但纤维膜纵向拉伸的断裂伸长率显著增大,纵向拉伸的弹性模量显著降低。原因在于处理后的纤维沿取向方向产生屈曲结构,拉伸初期这种波纹状的屈曲结构逐渐伸直,纤维本身未受到拉伸,因此表现为纤维膜的弹性增强。卷曲-蓬松PPDO纤维膜纵向拉伸强度略有增大,从(4.13±0.28)MPa增至(5.31±0.32)MPa,其断裂伸长率和弹性模量几乎没有变化,说明卷曲处理和蓬松处理对纤维膜的纵向拉伸起到了一定的增强作用。

由图10可知,蓬松处理后,纤维膜的横向拉伸性能显著提高,横向拉伸强度由原取向纤维膜的(0.18±0.01)MPa增至(0.28±0.01)MPa,断裂伸长率变为原取向纤维膜的两倍多,弹性模量也略有提高。推测原因可能是蓬松处理在横向上对纤维产生分簇作用,从而纤维在横向上随机发生分散,且部分位置有纤维沿取向方向随机聚集成簇,成簇的纤维间的缠结增强,并且各簇纤维在不同位置的缠结状态不同,表现为横向拉伸性能显著提高。卷曲处理仅对纤维膜的横向拉伸强度有所增强,对纤维膜的断裂伸长率和弹性模量的影响不显著。同时经过蓬松处理和卷曲处理的纤维膜在横向上的拉伸强度[(0.25±0.02)MPa]、断裂伸长率[(167.67±38.22)%]以及弹性模量[(0.97±0.12)MPa]均有增大,说明卷曲处理并未削弱蓬松处理对纤维膜横向拉伸性能的提高作用。

图10 不同PPDO纤维膜横向拉伸测试结果Fig.10 Tensile results of different PPDO fiber membranes in horizontal direction

2.6 细胞毒性分析

纤维的微观几何结构对细胞的形态、黏附、增殖等具有调节作用,进而影响组织的再生重塑。采用CCK-8法对不同的PPDO纤维膜进行细胞增殖试验,结果如图11所示。由图11可知,试验所用的4种PPDO纤维膜在1 d的细胞增殖率均在80%以上。根据表1的评级标准,4种PPDO纤维膜对应的细胞毒性级别均在Ⅰ级以下,表明上述纤维膜未产生细胞毒性,细胞黏附良好,说明蓬松处理和卷曲处理过程未对材料的细胞相容性产生影响,即处理后的PPDO纤维膜仍具有良好的细胞相容性。

图11 不同PPDO纤维膜的细胞增殖率Fig.11 Cell viability of different PPDO fiber membranes

2.7 细胞形态分析

免疫荧光染色可直观反映材料对细胞形态的影响,结果如图12所示。由图12可知,4种PPDO纤维膜上细胞数量均随着培养时间的增加而增加。培养1 d后,纤维膜上的细胞均呈取向排列;培养3、7 d后,细胞取向排列更显著,说明处理前后的纤维膜均能够诱导细胞沿着纤维取向方向进行取向生长和排列。相比空白对照组,纤维膜上的细胞形态更加纤长,排列更加规则有序,这是因为卷曲处理和蓬松处理使得纤维具有了屈曲结构并且增大了纤维间隙,有利于细胞的长入。

图12 不同PPDO纤维膜在1、3、7 d时的免疫荧光染色图Fig.12 Immunofluorescence staining of different PPDO fiber membranes at 1, 3, 7 d

3 结 语

通过对采用静电纺丝技术制备的PPDO取向纤维膜进行蓬松处理和卷曲处理,成功制备了4种不同结构的PPDO纤维膜,并对其结构与性能进行测试。结果表明:相比取向纤维膜(比表面积为4.094 m2/g),处理后纤维膜的比表面积显著增大(5.112 m2/g),纤维膜的孔隙体积由1.31×10-2cm3/g增至2.19×10-2cm3/g;纤维膜表面的水接触角从(125.26±2.33)°减小至(93.16±7.06)°,说明纤维膜的亲水性有明显改善。卷曲-蓬松处理PPDO纤维膜的纵向拉伸强度从(4.13±0.28)MPa增至(5.31±0.32)MPa,横向拉伸强度从(0.18±0.01)MPa增至(0.25±0.02)MPa,说明卷曲处理和蓬松处理提高了纤维膜整体的拉伸力学性能。4种PPDO纤维膜均无细胞毒性,处理后的纤维膜仍能够诱导细胞取向排列生长,具有良好的生物相容性。综上所述,卷曲-蓬松PPDO纤维膜兼具优异的拉伸力学性能和良好的细胞相容性。该材料具有应用于组织工程再生修复的潜力。