云南昆明烟草主产区根结线虫种类及分布研究*

徐兴阳,彭昌田,顾进坤,李凤丽,李浩昊,李 顺,胡先奇

(1.云南省烟草公司 昆明市公司,云南 昆明 650051;2.红河佳裕农业科技有限公司,云南 红河 654300; 3.云南省烟草公司 文山州公司,云南 文山 663000;4.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201)

烟草具有重要经济价值,其产业在我国具有重要地位.烟叶生产可以帮助烟农增收,巩固全面脱贫实现全面小康,助力乡村振兴.在烟叶生产中,烟草病虫害可直接影响烟叶的品质与产量,成为烟叶生产的重要制约因素.当前,我国较为流行的烟草病害主要包括烟草黑胫病、烟草花叶病、番茄斑萎病毒病、烟草根结线虫病和赤星病等,其中烟草根结线虫病备受关注.

烟草根结线虫病属于世界性病害,在我国各大烟区呈逐渐加重趋势,造成重大经济损失,已成为烟草生产的重要限制因子.朱斌等[1]研究表明陕南烟区烟草根结线虫病发病率最高可达100%.云南烟草根结线虫病年发病面积超过3.3×104hm2,损失烟叶比例范围在20.0%～30.0%,严重达50.0%以上[2],其中昆明烟草受根结线虫危害最严重的一次其局部连片受灾面积达到 400 hm2[3].

根结线虫(Meloidogynespp.)属于垫刃目(Tylenchida),异皮科(Heteroderidae),根结线虫属(Meloidogyne),其适应能力、繁殖能力强,寄主植物超过3 000种[4].根结线虫幼虫有4个龄期,从卵中孵化出的2龄幼虫具有侵染能力,2龄幼虫主要从根冠伸长区侵入寄主,通过口针的穿刺作用使食道腺分泌的酶入侵根部组织,导致根结的形成[5].

我国烟草根结线虫病主要有南方根结线虫(M.incongnita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)[6],根据已有的调查结果,在我国大部分地区,南方根结线虫是主要的优势种.对烟草根结线虫的鉴定主要采用形态特征和分子生物学特征分析.形态特征主要包括:雌成虫会阴花纹、雌成虫和2龄幼虫形态特征.分子生物学鉴定常用方法主要有聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、序列特异性扩增区(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)等.Carolien等[7]基于SCAR-PCR技术,设计了3对特异性引物,准确鉴定出南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫.杜惠等[8]利用 rDNA-ITS-PCR 技术通过11个根结线虫种群进行分析,确定甘肃当地蔬菜根结线虫种类为南方根结线虫.

云南省是全国最主要的烟叶产区,昆明市作为云南烟叶产区的重要组成部分,其烟叶品质与产量一直深受行业高度关注.然而,当前昆明烟草根结线虫病已成为烟草种植过程中的主要病害,局部区域已经成为决定性制约因子.本文拟通过对昆明全市烟草主要种植区开展根结线虫病病害调查及病原鉴定,以确定根结线虫种类及分布,以期为科学指导防控提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

显微镜(Leica DM 2000);PCR仪(Applied Biosystems 2720型);电子天平(先行者);超低温冷冻储存箱(DM-HL 398 S型、DM-HL 528 S型,中科美菱生产);标准检验筛;移液枪;凝胶成像仪(LG 2020型,杭州朗基科学仪器有限公司生产);LX-100手掌型离心机(海门市其林贝尔仪器制造有限公司).

1.1.2 主要试剂

10×PCR Buffer(Mg2+,free);25 mmol/L MgCl2、Tap酶;dNTPs;蛋白酶K (20 mg/mL);DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒;DL 200 DNA MarKer;6×Loading Buffer.

1.2 根结线虫样本采集与保存

2021年9月8日至14日,昆明市烟草技术中心集中采集109个根结线虫病害样本.采集地点主要是昆明市8县(市、区)的主要种植区,以烟站为单位,根据面积大小每个烟站取1～3个样本,对样本进行编号,取根部于自封袋中 4 ℃ 保存(表1).

表1 烟草根结线虫病样本信息

1.3 根结线虫种类鉴定

1.3.1 根结线虫各虫态的收集

1)雌成虫收集

将患根结线虫病烟株根部用水冲洗干净,采用直接解剖法获取雌成虫[9].在体视镜下,用镊子固定好根,再轻轻挑起根结外部组织,直到雌虫外部植物组织处理干净为止,然后在雌虫的一侧由底部慢慢挑起成熟饱满的雌虫,一部分用于分子鉴定,另一部分用于会阴花纹鉴定及测量.

2)卵块及2龄幼虫的收集

在体视镜下,直接从根结中挑取乳白色、透明、粘状物的卵块堆积物,获得的卵块放入 10 mL 离心管中,加入适量清水,在室温或 28 ℃ 恒温培养箱中孵化.

1.3.2 土壤中2龄幼虫的收集及计数

使用浅盘法分离土壤中2龄幼虫:取干净盆筛,在筛上铺面巾纸,称取 100 g 土壤平铺于纸上,向盆中注入适量清水,水量以刚浸湿土壤为宜,水平静置 48 h 后,用上层100目、下层500目的套筛冲洗盆底的线虫悬浮液,收集500目筛上的2龄幼虫至直径约为 6 cm 的培养皿中,水平静置过夜后计数.

1.3.3 根结线虫形态学鉴定

雌成虫会阴花纹鉴定具体步骤参考徐兴阳等[10]的方法,具体步骤如下:

1)在雌成虫收集中选出成熟饱满的雌虫,放入干净的并滴有45%乳酸的有机玻璃板上;

2)在解剖镜下,用解剖刀切取含有会阴花纹的角质膜,并在乳酸中用柔软的纤维刷轻轻刷洗角质膜上黏附的组织,清洗干净;

3)取干净的载玻片,以甘油作为浮载剂,于显微镜下观察并拍照记录.

雌成虫形态测量方法:把制作好拨片放入LEICA显微镜下于LASAF软件下进行测量,每个种群至少测量20头雌成虫[11].具体测量指标见表2.

2龄幼虫形态测量方法:将2龄幼虫置于63～65 ℃ 的水浴锅中水浴2～3 min 杀死后,用4%甲醛溶液固定保存[12],用于形态指标测量,具体指标见表2.

表2 形态测量指标及符号

表3 PCR扩增反应试剂及用量 μL

使用Excel 2016统计并计算各个测量指标,最终以“平均值±标准差(最小值-最大值)”的形式表述.

1.3.4 根结线虫分子生物学鉴定

DNA提取参照Adam等[13]的方法,略微改进,具体步骤如下:

1)完成灭菌的PCR管加入 5 μL ddH2O;

2)挑选其成熟的雌成虫放入PCR管中;

3)用灭菌枪头将虫体刺破;

4)加入 5 μL 的细胞裂解液(1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+,free)、0.8 μL MgCl2、0.05 μL 蛋白酶K、3.15 μL ddH2O,放入液氮中冷冻 20 min,加入 10 μL 液状石蜡,短暂离心,置于PCR仪中 56 ℃ 反应 80 min,95 ℃ 反应 15 min,得到根结线虫DNA提取液.

rDNA-ITS区、mtDNA-COI区序列进行扩增,具体方法如下:

根据形态鉴定出本次实验主要种群,由此采用特异引物进行扩增反应,反应体系、引物和反应程序分别为表3、表4和表5.PCR反应完成后,用 5 μL 的扩增产物与 1 μL 6×DNA Loading buffer混合,注入1.2%的琼脂糖凝胶孔中,110 V、180 mA 条件下电泳 30 min,使用凝胶成像系统观察拍照.

表4 所用引物信息

表5 PCR反应程序

2 结果与分析

2.1 昆明产区土壤中2龄幼虫数量统计

从表6可知,各地区土壤中根结线虫2龄幼虫数量按以下顺序依次降低:嵩明、寻甸、石林、禄劝、富民、晋宁、宜良、安宁.其中嵩明产区土壤中2龄幼虫数量最多,高达每 100 g 土壤中585.90头.

表6 各县(市、区)土壤样本中2龄幼虫的平均数量 头/(100 g土壤)

2.2 烟草根结线虫形态学鉴定

经形态学分析，昆明烟区发生根结线虫主要有南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫和未知根结线虫，其线虫种类间具有复合侵染特征.在109个样品中，检出存在南方根结线虫样本占89.0%，花生根结线虫占41.3%，爪哇根结线虫占53.2%，未知线虫占12.8%.可见昆明产区危害烟草根结线虫的种类以南方根结线虫为主，爪哇根结线虫和花生根结线虫次之.

2.2.1 烟草根结线虫形态特征及种类描述

根结线虫各个种之间存在着细微的差别，此差别可以成为重要的鉴定依据，3种根结线虫形态特征描述及比较列于表7.

表7 根结线虫形态特征描述及比较

(a)2龄幼虫

(b)2龄幼虫头部

(c)龄幼虫尾部

(d)雌虫

(e)雌虫头部

(a)2龄幼虫

(b)2龄幼虫头部

(c)龄幼虫尾部

(d)雌虫

(e)雌虫头部

(a)2龄幼虫

(b)2龄幼虫头部

(c)龄幼虫尾部

(d)雌虫

(e)雌虫头部

2.2.2 会阴花纹形态特征

会阴花纹是品种鉴别的一个重要指标，3种不同的根结线虫进行了描述和对比列于表8.

表8 会阴花纹特征描述及比较

(a)花生根结线虫 (b)南方根结线虫 (c)爪哇根结线虫图4 根结线虫雌成虫会阴花纹

对2龄幼虫及雌成虫进行测量后统计2龄幼虫测量值(表9)，及雌成虫的测量值(表10)，并进行比较.结果表明其测量数据与赵洪海等[11]描述基本相符.

表9 昆明产区烟草根结线虫2龄幼虫形态指标 μm

续表9 μm

表10 昆明产区烟草根结线虫雌成虫形态指标 μm

2.3 昆明产区烟草根结线虫混合侵染结果及分析

由表11可知，昆明产区主要的根结线虫有3个种，组成的混合侵染有4种类型，混合侵染样品占样本总数比例分别是12.8%、49.5%、17.4%和11.9%，合计达到91.6%.可见在4种混合侵染中南方根结线虫/爪哇根结线虫混合侵染比重最大，其余种类复合侵染比重相对较少.

表11 昆明产区烟草根结线虫混合侵染形态鉴定结果

2.4 分子生物学鉴定分析

应用SCAR技术进行根结线虫DNA 的PCR扩增.南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫目的条带分别约为 1 200，420，700 bp(图5、图6、图7).

图5 南方根结线虫PCR扩增片段电泳图

图6 花生根结线虫PCR扩增片段电泳图

图7 爪哇根结线虫PCR扩增片段电泳图

2.5 昆明产区烟草根结线虫主要种类分布

通过形态学和分子生物学技术结合，本次在昆明8县(市、区)采集的109个标本中鉴定出3种根结线虫，分别是南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，它们在所调查的县(市、区)均有发现，具体分布及混合种群的情况详见表12、表13.

表12 根结线虫侵染样品数(包括混合侵染)分布

表13 根结线虫混合侵染检测样品数分布

3 讨论

通过形态学、分子生物学鉴定方法对昆明8县(市、区)烟草根结线虫种类进行鉴定，109个病害样品共鉴定出：南方根结线虫97份占比89.0%，花生根结线虫45份占比41.3%，爪哇根结线虫58份占比53.2%，未知种14份占12.8%，混合侵染南方根结线虫与花生根结线虫样本占比12.8%，南方根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染样品占比49.5%，花生与爪哇根结线虫混合侵染样品占比17.4%，南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫混合侵染样品占比11.9%.通过以上数据可以看出南方根结线虫为优势种，其次是爪哇根结线虫和花生根结线虫.

4种主要根结线虫[6]在我国均有发现，但北方根结线虫只在较为寒冷地区，如在贵州、河南等地有所发现[14，15].2016年在临沧、玉溪、曲靖、文山及云南省1997年分别检出了南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以花生根结线虫为主要病原，并对其进行了研究[9].1998年喻盛甫等研究发现，在云南省烟草根结线虫的优势种群由南方根结线虫转变为花生根结线虫[16].1998年在河南、湖北和四川[17]和2013年在昆明主要县(区、市)[3]，同时检测出南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，其中南方根结线虫为优势种群.

喻盛甫等1998年研究发现云南省烟草根结线虫主要群体从南方根结线虫向花生根结线虫转移[16].徐兴阳等2013年研究发现昆明主要县区烟草根结线虫优势种群为南方根结线虫[3]，1998年—2013年15年时间中，昆明产区烟草根结线虫优势种群为南方根结线虫，预示着品种布局的变化可能是改变昆明烟草主产区根结线虫优势种群的重要因子.本次实验得出南方根结线虫占比高达89.0%，根据南方根结线虫的为害特性，根结线虫病可能将对昆明烟草的产量、质量及生态环境、经济收益造成重大影响.

1991年张绍升发现同一株由多种根结线虫共同侵染的烟草病株[18]；2017年徐兴阳等对昆明市主要烟区进行根结线虫初步鉴定中发现混合侵染占11.54%，主要为花生根结线虫和爪哇根结线虫混合侵染[19]；杨艳梅等[20]在昆明、曲靖和玉溪的主要烟区调查发现调查样本中混合侵染达到40.75%.本次调查也发现混合侵染存在，总和达到了91.6%.这和以往的研究报到总体相符，但混合侵染占比有了明显增加.这一结果或许预示着，烟草下一步的育种目标中应考虑抗多种根结线虫烟草品种的培育，在现阶段的生产实践中应加强对混合侵染的预防和关注.

4 结论

通过形态学及分子生物学鉴定，明确了危害昆明8县(市、区)烟草的根结线虫有：南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，占比分别是89.0%、41.3%和53.2%，未知种占12.8%.混合侵染种类为：南方根结线虫与花生根结线虫，南方根结线虫与爪哇根结线虫，花生根结线虫与爪哇根结线虫，南方根结线虫、花生根结线虫与爪哇根结线虫，占比分别是12.8%，49.5%，17.4%和11.9%.