HPLC测定甲磺酸二氢麦角碱缓释片有关物质

张发成，张 丹，管 岚，万竹青，蒋雪琴

(1.宝利化(南京)制药有限公司，江苏 南京 210038；2.南通大学，江苏 南通 226001)

甲磺酸二氢麦角碱 (1)是天然麦角生物碱的四种双氢衍生物的混合物，其组分包括甲磺酸二氢麦角考宁、甲磺酸二氢麦角汀和甲磺酸二氢-α-麦角隐亭、甲磺酸二氢β-麦角隐亭。依舒佳林 (1缓释片)是1、卡波姆934P等经制粒压片而成，临床上用于治疗脑血管病后遗症和老年病人的轻度血管性痴呆等[1]，具有临床效果显著、副作用小等优点。检验过程中发现色谱柱使用寿命较短，且发现加速试验中的样品有关物质和含量数据物料不平衡。经检索文献[2-3]发现，色谱柱寿命短，可能系卡波姆特性所致。因此，有必要研究新的样品前处理及有关物质检测方法，以改善这一不足。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Waters e2695-2489，色谱工作站Empower3，电子天平Mettler Toledo XSE105DU (0.001 mg)，pH计Sartorius PB-10，超声仪深圳歌能GS-100A，高速离心机赫西仪器 TG16MW。

试验样品，宝利化(南京)制药有限公司，批号2110003、2106002、2009001、2004001。

甲醇为TEDIA HPLC级，批号21095154；盐酸为分析纯，南京化学试剂股份有限公司，批号为210306345H；磷酸氢二铵为分析纯，南京化学试剂股份有限公司，批号为151019975E；氯化钠为分析纯，南京化学试剂股份有限公司，批号为201212699F；氯化钙为分析纯，国药集团，批号：20191127。

2 试验过程与结果

2.1 方法确定

按高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)的方法测定。取本品，研细，称取细粉适量(约相当于甲磺酸二氢麦角碱 5 mg)，置 25 mL 量瓶中，加入2%的氯化钠溶液 15 mL，摇匀，静置 2 h，超声处理 5 min，加乙腈稀释至刻度。摇匀，离心(10000 r/min，5 min)，取上清液经孔径为 0.45 μm 的滤膜(材质PTFE)过滤，弃去 2 mL 初滤液，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液 1 mL，置 50 mL 量瓶，用水-乙腈(体积比3∶2)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(2%)。称取丁基羟基苯甲醚约 8 mg，置 25 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液；移取 1 mL 储备液至 100 mL 量瓶中，用水-乙腈(体积比3∶2)稀释至刻度，摇匀，作为丁基羟基苯甲醚溶液。精密量取对照溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用水-乙腈(体积比3∶2)稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液(0.2%)。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Phenomenex Gemini C18柱，φ4.6 mm×250 mm，5 μm 或效能相当的色谱柱)；以甲醇作为流动相A，0.005 moL/L 磷酸氢二铵(用10%磷酸调节pH至2.5±0.2)为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱；检测波长为 280 nm，进样体积为 25 μL。

表1 洗脱梯度表

精密量取灵敏度溶液 25 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，主峰2的信噪比应不小于10。取对照溶液和供试品溶液各 25 μL 依次注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中主峰之间分离度应符合要求，如有杂质峰，主峰与相邻杂质的分离度应符合要求，扣除辅料峰后，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液色谱峰面积之和(2%)，小于灵敏度溶液(0.2%)主峰1峰面积的峰忽略不计。

2.2 前处理方法的开发

经检索相关文献[3]发现，卡波姆在pH 6～12时可形成水凝胶的结构，较为粘稠；当pH<3或pH>12时，粘度下降。而原质量标准中所使用的流动相pH≈8，故推断导致色谱柱压力升高、峰型变差和柱效下降等问题可能与卡波姆在流动相中粘度有关。因此，样品前处理的重点是尽可能地去除供试品溶液中的卡波姆。

2.2.1 滤膜筛选

将同一溶剂空白溶液分别用不同材质的滤膜滤过后进样检测(色谱条件采用原标准方法)，同时与未过滤溶剂空白图谱进行对比研究。试验结果显示PTFE的滤膜过滤后溶剂空白中未出现干扰峰。

取同1份样品溶液，离心处理 5 min(10000 r/min)后，分别用不同品牌的同材质(PTFE)同孔径大小(0.45 μm)同规格(直径 13 mm)的微孔滤膜滤过，分别取弃去 0、1 和 2 mL 后溶液进样检测。试验结果显示，品牌为泰坦的PTFE滤膜，对1缓释片中杂质几乎无吸附，当弃去体积为0～2 mL 时，所测杂质总量均保持不变；而品牌为津腾的滤膜对杂质存在吸附，随着弃去体积的增加，杂质总量逐步提高，当弃去体积增加至2 mL时，杂质总量与使用泰坦品牌滤膜所测结果一致。

2.2.2 提取溶液筛选

文献报道[2-3]卡波姆可与阳离子，如Na+、Ca2+和Al3+等形成沉淀。向供试品溶液中加入不同浓度的含阳离子的溶液，使卡波姆胶体形成沉淀后除去。计算新处理方法对主成分和杂质提取率，同时考察滤过阻力。结果显示，用CaCl2溶液和NaCl溶液处理后供试品的主成分相对于原方法提取更完全，但CaCl2溶液在溶剂峰位置存在较大干扰峰，且对杂质的提取率偏低；1%NaCl溶液对主成分和杂质提取率略高于2%NaCl，但2%NaCl溶液处理后供试品溶液的滤过阻力明显小于1%NaCl溶液。

2.2.3 提取方法筛选

原质量标准[4]中有关物质供试品溶液的制备，采用“放置 2 h 后，充分振摇 10 min”，该步骤可能对1缓释片中甲磺酸二氢麦角碱的提取率有比较大的影响，故设计试验验证：分别称取约 500 mg 的1缓释片片粉，置量瓶中，加占量瓶体积60%的氯化钠溶液，摇匀后静置 2 h，分别以旋涡振摇5/10/15 min、摇床振摇1/2/3 h、超声5/10/15 min 后用乙腈稀释，测定总峰面积。结果显示，超声5分钟，对主成分甲磺酸二氢麦角碱的提取率最高，且超声方式更为便捷快速。

2.3 色谱条件的开发与优化

2.3.1 色谱系统的初步建立

在原质量标准方法基础上，采用梯度条件对供试品进行初步分离，经考察，确定初始有机相体积比为10%。结果显示主成分色谱峰峰型及主成分峰与相邻杂质峰的分离都得到极大改善。

2.3.2 缓冲盐浓度优化

将流动相A中缓冲盐浓度从 0.010 moL/L 降低至 0.005 moL/L 进行试验，此时，色谱图中基线漂移及干扰情况得到明显改善，样品中杂质与主成分峰基本得到分离。

2.3.3 流动相pH筛选

分别将流动相A的pH调至2.0、2.5和3.0，其余色谱条件不变，考察1缓释片在不同pH值流动相中有关物质分离情况。结果显示，流动相体系pH为3.0时，主峰2和主峰3间的分离度有所下降，同时杂质的检测灵敏度也有所下降。当流动相pH为2.0时，基线波动幅度变大，故综合考虑，选择流动相pH为2.5。

2.3.4 柱温筛选

考察1缓释片在不同柱温下有关物质的分离情况，和2%对照溶液在不同柱温下的信噪比。结果显示当柱温设为 40 ℃ 时，基线抬高明显，且主峰2、3间分离度也明显下降，而当柱温设为 30 ℃ 时，2%对照溶液中主峰2的信噪比下降明显。

2.4 色谱条件优化

2.4.1 试验结果

据单因素试验结果，以柱温、pH值、缓冲盐浓度为自变量，以分离度(R1)、基线S/N(R2)为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验。中心点重复2次，响应面因素及水平设计见表2。

2.4.2 模型方程的建立与方差分析

应用Design-Expert 12对表3中的数据进行二次多元回归拟合，得到流动相pH值、缓冲盐浓度、柱温与色谱峰分离度之间的二次多项回归方程：R1= -0.0975A2-0.0075B2-0.0225C2-0.015A×B+0.025A×C-0.015B×C-0.1A+0.01B-0.0625C+1.65。统计分析结果见表4，模型项P<0.01说明R1与x回归方程的关系是极显著的，该模型可用。

表2 Box-Behnken试验因素和水平

表3 Box-Behnken试验设计及数据处理

表4 方差分析结果—分离度

对表3中的数据进行二次多元回归拟合，得到流动相pH值、缓冲盐浓度、柱温与基线S/N之间的多项回归方程：R2=0.0125A-0.6B+1.29C+18.49。统计分析结果见表5，模型项P<0.01说明R2与x回归方程的关系是极显著的，该模型可用。

2.4.3 响应曲面分析

应用Design-Expert软件进行进一步优化；根据回归模型作出相应的响应曲面图和等高线图，考查拟合响应曲面的形状，分析各因素对分离度的影响，结果见图1，图1反映了三因素中任意两因素的交互作用对分离度的影响。试验结果说明流动相的pH值和缓冲盐浓度对分离度的交互影响最大。而依据各因素对S/N的方程，可知各因素对S/N没有交互影响。

表5 方差分析结果-信噪比

图1 各因素交互作用的响应面和等高线图

2.4.4 参数优化

通过软件分析，响应面法优化的分离度最佳条件以分离度、信噪比最大为目标，做条件优化，求出最佳色谱条件为pH值=2.3，缓冲盐浓度为 5 mmoL/L，柱温 36.4 ℃，此时分离度为1.63，S/N为19.4。鉴于色谱柱的耐受性pH值取2.5，柱温取 35 ℃，缓冲盐浓度仍为 5 mmoL/L，此时理论分离度为1.63，S/N为19.1。分离度、基线S/N可以接受。以此条件试验，结果分离度为1.65，S/N为19.5。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性研究

以乙腈-2%NaCl溶液(体积比2∶3)为溶剂，试验结果显示空白溶剂无干扰。经单辅料定位确认 28 min 峰为淀粉引入，54 min 峰为丁基羟基苯甲醚引入，空白辅料典型图谱如图所示。

图2 空白辅料色谱图

图3 辅料丁基羟基苯甲醚定位图

图4 供试品溶液色谱图

2.5.2 破坏试验

将1缓释片研成细粉后，分别于光照、高温、酸、碱和氧化条件下进行强制破坏，考察其降解杂质与主成分的分离，以及物料平衡情况。结果显示，1缓释片的片粉在光照、高温、酸、碱和氧化条件下均有所降解，其中酸、碱降解产物一致；强光降解的样品外观变黄，各降解条件下物料平衡均达到95%以上，并且在各降解条件下产生的降解杂质与主峰间均能达到基线分离，主峰纯度检查均符合要求。

2.5.3 定量限与检测限

将2%对照溶液逐级稀释后分别进样，计算各主峰信噪比，试验结果显示，0.2%对照溶液各主峰S/N值均大于10，故0.2%对照溶液为定量限浓度，0.1%对照溶液各主峰S/N值均大于3，故0.1%对照溶液可作为检测限浓度。

图5 强制降解的色谱图

2.5.4 重复性

取定量限溶液(0.2%)，连续进样6次，结果RSD为1.80%，符合要求。

2.5.5 线性与范围

取供试品溶液，稀释制成0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的系列质量分数溶液，对应质量浓度分别为0.41、1.025、2.05、4.10、6.15 μg/mL，分别进样，以主峰面积和质量浓度作线性回归，求得线性回归方式为A=126625ρ+2334.8，相关系数r为0.99997，线性范围为0.41～6.15 μg/mL(0.2%～3.0%)。

2.5.6 溶液稳定性试验

对照溶液、供试品溶液室温放置 48 h 内总峰面积的变化均小于2.0%。

2.5.7 耐用性试验

将波长± 2 nm、柱温 ±2 ℃、流速 ±0.1 mL/min、初始甲醇比例±2%和流动相pH2.5±0.2，对各条件下的结果和标准条件下的结果对比。各变动色谱条件下系统适用性满足要求；各变动色谱条件下所测结果与初始条件结果相对偏差均≤5.0%。

2.6 样品检测结果

按照新开发的检测方法检测本品及近效期样品，以原产品的注册标准的有关物质限度判定。结果表明，新生产样品和近效期样品的有关物质均在2%的限度范围内，符合产品的注册标准。

表6 样品的有关物质检测结果

3 讨论

1)本品长期24个月，质量稳定，有关物质无明显变化；加速试验降解迅速，本文以加速试验6个月的产品作为有关物质方法开发的样品，所开发方法可有效分离各杂质峰。

2)原质量标准中1缓释片的处理方法是离心和过滤，不能有效去除卡波姆胶体。柱压升高、柱效降低的原因可能是当卡波姆进入色谱柱后，卡波姆结构中的羧基与C18柱中的硅醇基形成氢键而吸附在柱头，进而影响色谱柱的使用寿命。