胸腺肽α1对衰老小鼠肌肉减少症的调控机制

亚森江·买买提,买买提吐尔洪·吐尔逊,苏婷,穆克达斯·阿布力提甫,祖力菲亚·阿吉木,徐红

(新疆维吾尔自治区人民医院老年医学中心,乌鲁木齐830001)

肌少症是一种以运动能力降低和肌肉量减少为特征的疾病,该病可增加人们致残和致死的风险[1,2]。已知肌肉纤维在40岁后加速流失,到80岁时,肌肉将减少近30%,且难以有效治疗,严重影响患者的生活质量[3]。因此,亟待深入研究有效治疗肌少症的药物。胸腺肽α1是一种从小牛胸腺中分离出来高度保守的小肽段[4],在不同的生理和病理条件下(如感染、癌症、免疫缺陷、衰老),胸腺肽α1具有恢复体内平衡的特殊能力,根据宿主的炎症或免疫功能障碍状态,胸腺肽α1作为多任务蛋白发挥作用[5,6]。然而,胸腺肽α1对衰老导致的肌少症的作用并不清楚。本研究在地塞米松诱导的成肌细胞肌管直径减少模型和快速衰老型小鼠(SAMP8小鼠)中探讨胸腺肽α1对肌肉生成和肌肉萎缩的治疗作用,报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

小鼠成肌细胞(C2C12)购于武汉普诺赛生物科技有限公司;地塞米松(dexamethasone, DEX)和胸腺肽α1购于美国Sigma公司;杜氏改良培养基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)和10%胎牛血清购于美国Gibco公司;30只无特定病原级别(specified pathogen free, SPF)的雄性SAMP8小鼠(28.20±1.80)g购于北京华阜康生物科技股份有限公司;Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司;小干扰RNA针对沉默p62的重组载体(p62沉默载体)购于上海吉玛公司;细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)购于上海碧云天生物科技有限公司;SQSTM1/p62的第一抗体购于英国Abcam公司;肌球蛋白原D(myosinogen D, MyoD)、肌原细胞转录因子(myogenin, MyoG)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)、肌肉RING-指蛋白1(muscle ring-finger protein 1, MuRF1)、肌肉萎缩相关蛋白(muscle atrophy related protein, MAFbx)的第一抗体均购于英国Abcam公司,所有对应的第二抗体均购于英国Abcam公司;TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司;聚偏二氟乙烯膜购于美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 C2C12的培养和分组 C2C12在37°C的5% CO2培养箱中进行培养,培养基为含10%胎牛血清的DMEM,每2天更换一次培养基。为了诱导C2C12肌管形成,细胞在2%马血清诱导下培养6d,然后将细胞分为4组,包括对照组(PBS处理)、地塞米松组(50μmol/L地塞米松处理)、地塞米松+胸腺肽α1组(50μmol/L地塞米松联合50ng/ml胸腺肽α1处理)及地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默组(50μmol/L地塞米松、50ng/ml胸腺肽α1、联合p62沉默载体和Lipofectamine 2000混合处理),每组各处理24h。所有各组的细胞在37℃、5% CO2的稳定环境中培养。用显微镜标尺策略各组细胞肌管的直径。

1.2.2 CCK-8检测各组细胞的增殖活性 根据生产商提供的说明,将处理好的对照组、地塞米松组、地塞米松+胸腺肽α1组的C2C12接种于96孔板(5×103个细胞/孔)中过夜,然后与10μl CCK-8溶液在37℃下反应3h。随后,用酶标仪测定450nm处的吸光度(相对OD值)来表示细胞活力。

1.2.3 快速衰老SAMP8小鼠治疗和分组 将30只雄性SAMP8小鼠按照随机数表法分为SAMP8组、SAMP8+胸腺肽α1组、胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8组,每组10只。每组的处理方法如下:(1)SAMP8组的SAMP8小鼠接受静脉注射PBS;(2)胸腺肽α1+SAMP8组的SAMP8小鼠静脉注射10mg/kg的胸腺肽α1;(3)胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8组的SAMP8小鼠静脉注射10mg/kg的胸腺肽α1和5μg/kg p62沉默载体。

所有动物每天注射1次,注射7d,第7天对每组小鼠进行瘦体质量(lean body mass, LBM)和总体质量的测量,随后对所有动物进行安乐死,取小鼠比目鱼肌组织用于Western blotting实验检测。本研究中所有的动物实验通过新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会的批准(伦理审查号:202207024)。

1.2.4 Western blotting 用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)缓冲液裂解对照组、地塞米松组、地塞米松+胸腺肽α1组、地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默组细胞和SAMP8组、SAMP8+胸腺肽α1组、p62沉默+胸腺肽α1+SAMP8组小鼠肌肉组织的匀浆液。用二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)法定量提取液的浓度。将20μg蛋白样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶分离,转移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脱脂牛奶密封1h。将膜与一抗在4°C孵育24h,一抗包括p62 (1∶1000)、MyoD (1∶1000)、MyoG (1∶1000)、MyHC (1∶1000)、MuRF1 (1∶1000)、MAFbx (1∶500)。将膜与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶联的山羊抗兔IgG (1∶2000)一起孵育1h。与HRP偶联的二抗在37°C孵育2h。最后,应用电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)试剂显示蛋白条带,并用ImageJ软件分析每个条带的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 胸腺肽α1对小鼠成肌细胞C2C12增殖活性的影响

与对照组(1.00±0.13)比较,地塞米松组的增殖活性(0.82±0.09)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组(0.82±0.09)比较,地塞米松+胸腺肽α1组增殖活性(1.46±0.17)增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 胸腺肽α1通过激活自噬活性抑制性信号SQSTM1/ p62对小鼠成肌细胞肌管形成的影响

与对照组比较,地塞米松组中p62的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组比较,地塞米松+胸腺肽α1组中p62的表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松+胸腺肽α1组比较,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默组中p62的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05;图1,表1)。

表1 4组小鼠成肌细胞中SQSTM1/p62表达水平的比较

图1 Western blotting检测自噬活性抑制信号SQSTM1/p62的表达Figure 1 Western blotting detection of the expression of autophagy inhibitory signal SQSTM1/p62GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.3 胸腺肽α1对小鼠成肌细胞肌管形成的影响

与对照组比较,地塞米松组的肌管直径显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组比较,地塞米松+胸腺肽α1组肌管细胞形成的肌管直径显著增加,差异有统计学意义(P<0.05); 与地塞米松+胸腺肽 α1 组比较,地塞米松+胸腺肽 α1+p62沉默组的肌管直径显著减少,差异有统计学意义(P<0.05; 表2)。

表2 4组小鼠成肌细胞所形成肌管直径的比较

2.4 胸腺肽α1通过激活SQSTM1/p62信号对分化相关蛋白和肌少症相关蛋白表达的影响

与对照组比较,地塞米松组MyoD、MyoG、MyHC的表达水平显著降低,而MuRF1和MAFbx的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组比较,地塞米松+胸腺肽α1组MyoD、MyoG、MyHC的表达水平显著增加,而MuRF1和MAFbx表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松+胸腺肽α1组比较,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默组MyoD、MyoG、MyHC的表达水平显著降低,而MuRF1和MAFbx表达水平均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05;图2,表3)。

表3 4组小鼠成肌细胞中MuRF1、MAFbx、MyoD、MyoG及MyHC表达的比较

图2 C2C12细胞中细胞分化和肌少症相关蛋白的表达Figure 2 Expression of proteins associated with cell differentiation and sarcopenia in C2C12 cells MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; MyoD: myosinogen D; MyoG: myogenin; MyHC: myosin heavy chain; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.5 胸腺肽α1通过激活自噬活性抑制信号SQSTM1/p62抑制SAMP8快速衰老小鼠的肌少症

与SAMP8组比较,胸腺肽α1+SAMP8组的p62显著上调,差异有统计学意义(P<0.05);与胸腺肽α1+SAMP8组比较,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8组的p62显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与SAMP8组比较,胸腺肽α1+SAMP8组的瘦体质量(lean body mass, LBM)/体质量(body mass, BM)占比显著上调,差异有统计学意义(P<0.05);与胸腺肽α1+SAMP8组比较,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8组的LBM/BM占比显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与SAMP8组比较,胸腺肽α1+SAMP8组的MuRF1和MAFbx的表达水平显著下调,差异有统计学意义(均P<0.05);与胸腺肽α1+SAMP8组比较,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8组的MuRF1和MAFbx的表达水平显著上调,差异有统计学意义(均P<0.05;图3,表4)。

表4 胸腺肽α1治疗后SAMP8小鼠中p62和肌少症相关蛋白MuRF1、MAFbx的相对表达水平

图3 Western blotting检测胸腺肽α1治疗后SAMP8小鼠中p62和肌少症相关蛋白MuRF1、MAFbx的表达Figure 3 Western blotting analysis of p62 and sarcopenia related proteins MuRF1 and MAFbx in SAMP8 mice after thymosin α1 treatment MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

3 讨 论

骨骼肌占人体质量的40%以上,在生命中承担着重要的体力、能量消耗和代谢任务,但是衰老引起的肌肉萎缩和减少导致活动能力下降、跌倒的风险增加,最终影响生活质量;因此,肌肉萎缩也会增加肌少症发病率和死亡率[7]。此外,作为重要的内分泌器官,肌肉功能障碍也可引起肝脏和脂肪代谢紊乱。因此,预防或延缓肌肉萎缩的发生非常重要。然而,肌少症目前还没有有效的治疗方法[8]。在本研究中,胸腺肽α1在体内和体外均能有效改善肌少症相关特征;其中胸腺肽α1可以逆转因地塞米松诱导所导致的成肌细胞肌管直径减少,上调成肌相关蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表达。而在体内,胸腺肽α1显著抑制了衰老小鼠的肌少症相关蛋白MuRF1、MAFbx的表达并提高了小鼠瘦体质量在总体质量中的占比。这说明胸腺肽α1改善了衰老导致的肌少症。

地塞米松是一种常见的糖皮质激素药物,用于治疗多种炎症性疾病[9]。糖皮质激素对骨骼肌的作用是一把双刃剑。一方面,糖皮质激素通过协调葡萄糖、脂质和蛋白质的代谢来维持代谢平衡;另一方面,长期和高剂量使用糖皮质激素可能导致许多被动效应,包括肌少症[10,11]。在使用类固醇药物超过4周的患者中,非炎症肌病的发生率超过50%[12]。由于导致肌少症的病因的多因素变化,肌少症的潜在发病机制尚不完全清楚。目前的研究发现,地塞米松诱导活性氧上调,通过糖皮质激素受体激活泛素-蛋白酶体和溶酶体途径,导致肌肉萎缩[13]。本研究中,给药地塞米松导致成肌细胞的肌管直径减少,且肌少症相关蛋白MuRF1和MAFbx的表达都显著增加,这表明体外地塞米松处理成肌细胞可以形成肌少症的细胞特征。另外,地塞米松组中成肌相关蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表达明显减少,而当单独使用胸腺肽α1治疗后,肌管直径和成肌相关蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表达都明显增加,而肌少症相关蛋白MuRF1和MAFbx的表达都减少。已知MyoD、MyoG、MyHC等是肌生成的标志物和关键调节因子[14]。MuRF1和MAFbx则是与肌肉萎缩相关的蛋白,研究表明,MuRF1和MAFbx水平在肌少症的早期上调,并在整个肌肉萎缩期保持高水平。MuRF1和MAFbx的敲除对小鼠去神经支配诱导的肌肉萎缩具有保护作用[15,16]。这表明了地塞米松诱导的体外肌少症可以被胸腺肽α1所部分逆转。

自噬是真核生物细胞质中极为保守的分解代谢过程,异常细胞器被转运到溶酶体中降解,进行细胞器的再循环和更新。因此,自噬是维持细胞稳态所必需的,在代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用[17]。已有研究表明,自噬的功能状态与骨骼肌萎缩密切相关,自噬过度和自噬不足均可导致肌肉萎缩[18]。本研究检测到无论地塞米松诱导成肌细胞还是SAMP8快速衰老小鼠,只要经过胸腺肽α1的治疗,均可以显著提高自噬活性抑制信号SQSTM1/p62的表达。而当沉默p62后,则逆转了因胸腺肽α1治疗对MyoD、MyoG、MyHC的表达促进作用,并且明显抑制小鼠的MuRF1和MAFbx的表达以及显著减少LBM在总体质量中的占比。这表明,抑制细胞自噬的活性是胸腺肽α1治疗肌少症中必不可少的过程。

综上所述,本研究发现胸腺肽α1能有效抑制肌管和肌肉萎缩。进一步的机制探索证实,胸腺肽α1通过激活成肌细胞和衰老小鼠体内的自噬活性抑制的信号SQSTM1/p62从而发挥改善肌少症的作用。本研究为衰老导致的肌少症提供了有前途的治疗靶点。