诺卡氏菌口服疫苗的制备与免疫效果研究

吴雅婷，武尊，高浩峰，何学欣，程浩森，邵蓬

（天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

珍珠龙胆石斑鱼（褐点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus ♀× 鞍带石斑鱼E.lanceolatus）是一种肉质细嫩、生长速度快、抗病力强，具有很大潜在市场价值的石斑鱼杂交种。研究表明，诺卡氏菌对石斑鱼（Epinephelus sp.）、红笛鲷（Lutjanus sanguineus）等主要海水养殖鱼类同样具有致病性。随着海水种苗频繁的流通和检验措施的缺乏，诺卡氏菌有蔓延和传染其他鱼类的趋势，发病率也日益增加[6]。

目前多用抗生素防治诺卡氏菌病，但水产品质量和环境污染问题日益突出，且不同地区、不同来源和不同宿主的菌株对某些抗生素的敏感性往往差异较大，为诺卡氏菌病的治疗带来了较大的困难。诺卡氏菌病疫苗的研究大多集中在福尔马林灭活疫苗、弱毒疫苗等。这些传统疫苗在养殖生产中均未得到大规模的推广和应用，且尚未见到口服疫苗防治的研究。从动物福利、方便程度、节省成本等角度考虑，口服接种都是水产动物比较理想的免疫接种方式。口服免疫一般采用拌饲口服，将疫苗口腔灌入，经胃、肠进入鱼类后肠部位被吸收，引发免疫应答以研究疫苗的免疫性能。相同免疫效果下，口服免疫是水产养殖最为理想的免疫接种方式。本实验采用海藻酸钠天然高分子聚合物作为诺卡氏菌全菌灭活疫苗的包被载体制作口灌疫苗，分析评价了该疫苗的安全性和保护效果，意为我国诺卡氏菌病害的防控和疫苗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 灭活疫苗的制备

1.3 口服疫苗的制备

参照薛淑霞等[7]的专利，结合诺卡氏菌的形态特征及生长特性等，选用海藻酸钠作为口服疫苗的载体，制备NK1001 灭活疫苗微球，口灌珍珠龙胆石斑鱼。操作步骤如下：

（1）将灭活的浓度为1×108CFU/mL 诺卡氏菌菌液，加入到等体积、质量浓度为3%的海藻酸钠水溶液中，磁力搅拌器中600 r/min，10 min；

（2）将上述溶液按体积比1∶2 加入花生油，得到水油混合物，加入水油混合物体积1%的span80，1 200 r/min 搅拌15 min；

（3）加入等体积的质量浓度4%CaCl2水溶液混合，1 200 r/min 搅拌15 min，800 r/min 继续搅拌1 h，形成油包水型乳液；

（4）3 000 r/min 离心4 min 去除上层油相和水相，留沉淀，重复两次；

（5）加入35%酒精清洗油相，加入离心管2/3 左右后混匀，12 000 r/min，离心10 min，重复三次；

（6）按照去除的水相和油相的总体积一倍的比例加入超纯水重悬，得悬浊液。

1.4 珍珠龙胆石斑鱼的免疫及样品采集

将健康珍珠龙胆石斑鱼随机分为两组：实验组杂交石斑鱼口服疫苗微球，对照组杂交石斑鱼口服生理盐水微球，每组80 尾。考虑到免疫耐受度和口服疫苗的总量，将投喂周期定为21 d，每次口灌200 mL，灌三停四为一周，后两次投喂可认为是加强免疫和二次加强免疫（图1）。

分别在第一次免疫后，第二次免疫前（1 d）；第二次免疫后，第三次免疫前（2 d）；第三次免疫后（3 d），免疫第一轮结束后（7 d）、免疫第二轮结束后（14 d）、免疫第三轮结束后（21 d）、免疫结束后一星期（28 d），按照7 个时间点，每次分别从免疫组和对照组随机选取9 尾石斑鱼分别取出头肾、肝脏、脾脏组织，于-80 ℃保存。

1.5 免疫保护率测定

在口服免疫4 周后进行攻毒实验，每尾腹腔注射100 μL诺卡氏菌液，攻毒浓度为1×108CFU/mL。记录数据，计算相对免疫保护率（RPS）。

1.6 石斑鱼肝脏相关免疫指标检测

从-80 ℃冰箱取出待检测肝脏组织，分别测定肝脏的碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）、过氧化氢酶（CAT）活性，及蛋白浓度（考马斯亮蓝法）。相关试剂配制、操作方法及计算公式参考南京建成生物工程研究所试剂盒内的说明书。

1.7 珍珠龙胆石斑鱼免疫基因表达变化测定

采用实时荧光定量PCR 方法检测免疫基因在对照组和免疫组不同时间的表达变化。将分别提取各实验组鱼头肾、脾脏、肝脏组织中的RNA，反转录得到相应的cDNA，以cDNA 为模板，利用免疫相关基因的引物[8-12]，进行PCR 反应。按照表1 在冰上制备荧光定量反应体系，免疫相关基因引物见表2。依据最佳反应条件，以β-actin 为内参进行荧光定量PCR，反应程序设定：95 ℃30 s；（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

表1 荧光定量反应体系Tab.1 Fluorescence quantitative reaction system

表2 免疫相关基因引物Tab.2 Primers of immune related genes

1.8 数据分析

数据采用2-△△CT法分析免疫基因相对表达量的变化，运用SPSS 23.0 软件统计学分析实验数据，应用GraphPad Prism 8.4.3 制图，用*表示数据差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 微球疫苗的粒径、包封率及人工胃液肠液情况

微球成球性较高，基本呈圆形，粒径相对均一，粒径普遍小于50 μm，平均为（33.85±7.53）μm，外部游离菌体少（图2）。

图2 海藻酸钠微球形态Fig.2 Form of sodium alginate microspheres

2.2 免疫保护实验结果

免疫周期结束7 d 后，对免疫组和对照组的攻毒试验结果表明，对照组在14 d 内全部死亡，实验组RPS 为67%。

2.3 口服疫苗对石斑鱼非特异性免疫指标的影响

石斑鱼在口服微球疫苗后，ACP 活力有两次显著升高（图3）：口服疫苗第3 d 和第7 d；对照组在第2 d 显著下降（P＜0.05），在3 d 和7 d 极显著升高（P＜0.01），在第21 d 和28 d 显著下降（P＜0.01），其余时间点均无显著变化；CAT 活力整体呈先升高再下降趋势，在免疫第后1 d、2 d、3 d 和7 d 极显著高于对照组（P＜0.01），在第28 d 显著低于对照组（P＜0.05），在第14 d 和28 d 无显著变化；LZM活力整体呈下降趋势，第1 d 和7 d 显著性升高（P＜0.05）在第2 d、21 d 和28 d 极显著下降（P＜0.01），其余时间点无显著变化。SOD 活力整体变化趋势为先降低后升高再降低的趋势，免疫后的第1～28 d 均显著低于对照组。

图3 疫苗免疫后石斑鱼肝脏中ACP、CAT、LZM、SOD 活性随时间的变化Fig.3 The changes in activities of ACP,CAT,LZM and SOD in liver of the hybrid grouper after vaccination with time

2.4 口服疫苗后珍珠龙胆石斑鱼部分免疫相关基因的表达

2.4.1 TLR 信号通路相关基因表达

如图4 所示，口服疫苗免疫后，石斑鱼基因TLR2 在头肾、脾脏、肝脏组织中的表达量均有上调趋势，在头肾中，除第7 d 和28 d 无显著性变化，其余时间均检测到显著上调；在脾脏中，除第28 d 无显著性变化，第14 d 显著性上调了8 倍；在肝脏中，除第2 d 和21 d 无显著变化，第1 d、第3 d、第7 d、第14 d 和第28 d 均检测到显著性上调。

图4 口服免疫后TLR 通路相关基因在各组织中的表达量Fig.4 The expression level of TLR pathway related genes in tissues after oral vaccination

基因TLR3 在头肾、脾脏、肝脏中的表达量均有上调趋势，在头肾中，除第28 d 无显著性变化，其余时间点均检测到显著性下调；在脾脏中，除第2 d 无显著性变化，其他时间点与对照组相比均检测到显著性上调，第21 d 显著性上调了8.3 倍；在肝脏中，除第7 d、21 d、第28 d 无显著性变化，第1 d、第2 d和第3 d 均检测到显著性上调，分别上调19.6 倍、3.0 倍和2.9 倍，而14 d 检测到显著性下调。

基因MyD88 在头肾中，除第3 d 和第28 d 无显著性变化，其余时间均检测到显著性上调；在脾脏中，各个时间点与对照组相比均检测到显著性变化，第3 d、21 d 分别上调了7.8 倍和11.7 倍；在肝脏中，除7 d、14 d 无显著性变化，第3 d 显著性下调，第1 d、2 d、21 d 和28 d 显著性上调，分别上调了14.5 倍、7.7 倍、6.1 倍和7.8 倍。

2.4.2 细胞因子类相关基因表达

口服疫苗免疫后，基因IL-12p40 在石斑鱼头肾中的表达，除第28 d 无显著性变化，其余时间均检测到显著性上调，第1 d、第2 d 和第3 d 分别上调了9.3 倍、8.0 倍和5.7 倍，整体趋势呈第一天增长随后递减；在脾脏中，除第2 d 无显著性变化，其他时间与对照组相比均显著性上调，第7 d 显著性上调12 倍；在肝脏中，在14 d、28 d 均检测到显著性上调，分别上调2.2 倍和7.0 倍，其他时间与对照组无显著性差异（图5）。

图5 口服免疫后IL-12p40 和TNF-α 在各组织中的表达量Fig.5 The expression level of IL-12p40 and TNF-α genes in tissues after oral vaccination

口服疫苗免疫后，基因TNF-α 在头肾中的表达，除第3 d 有显著性变化，21 d 无变化，其余时间与对照组相比有微量上调，但与对照均无显著性；在脾脏中，第1 d、21 d 和28 d 显著性上调，分别为18 倍、48 倍和20 倍；在肝脏中，与对照组相比所有时间显著性上调，第1 d 显著性升高117.1 倍，整体趋势先上升后下降，随时间变化趋于稳定，在第21 d和28 d 分别显著上调24.4 倍和38.8 倍。

2.4.3 细胞表面分子相关基因表达

口服疫苗免疫后，基因MHCII 在头肾中的表达，在第28 d 无显著性变化，其余时间显著性下调；在脾脏中，除第3 d、第7 d 和第21 d 无显著性变化，其余时间显著上调，其中第1 d 和第14 d 分别上调了19.9 倍和18.0 倍；在肝脏中，除1 d、2 d、7 d无显著变化，3 d、14 d、21 d 和28 d 分别显著上调4.2 倍、7.8 倍、7.6 倍和5.5 倍（图6）。

图6 口服免疫后杂交石斑鱼MHCII 在各组织中的表达量Fig.6 The expression level of MHCII genes in different tissues after oral vaccination

2.4.4 免疫球蛋白IgM 基因表达

口服疫苗免疫后，IgM 基因在头肾、脾脏中的表达，各时间点均比对照组显著性上调；在头肾中，在第2 d 是对照组的18.9 倍；在脾脏中，在第2 d 显著性上调15 倍；在肝脏中，除3 d、7 d 和14 d 无显著性变化，其他时间均显著性上调（图7）。

图7 口服免疫后IgM 基因在各组织在中的表达量Fig.7 The expression level of IgM genes in tissues after oral vaccination

3 讨论

非特异性免疫是鱼抵挡外来病原菌至关重要的屏障，其中相关酶类的作用是鱼类非特异性免疫的重要组成部分。酸性磷酸酶（ACP）是细胞免疫和体液免疫的综合体现，反映机体对外源微生物侵染的防御力。解俊等[8]将灭活的诺卡氏菌注射入乌鳢（Channa argus）后，其血清中的酸性磷酸酶活性显著增加。本实验中，免疫组与对照组相比在免疫后第3 d、7 d 显著升高，表明口服诺卡氏菌灭活疫苗使石斑鱼ACP 活性显著增强，ACP 活性升高意味着巨噬细胞被激活，提升了动物体内的应激水平，这与解俊等将灭活的诺卡氏菌对乌鳢免疫后的结果一致。

SOD 催化超氧化物自由基成为过氧化氢，再在CAT 的作用下将过氧化氢还原为水，是保护酶系统的重要组成部分。它可以增强巨噬细胞的吞噬活性，增强机体的免疫机能。CAT 在减少活性氧自由基和维持生物体内的细胞稳态方面同样也起着至关重要的作用[14,15]。因此，常将两种酶一起测定，其含量及活性高低间接反映养殖对象的健康状态及生理状况。李赫[16]等研究表明，在饲料中添加免疫增强剂，发现CAT 变化不显著而SOD 活性显著高于对照组。而在本试验中，CAT 活力免疫组与对照组相比第1 d、2 d、3 d、7 d、21 d 含量显著性升高，说明石斑鱼受免疫后，增强了鱼体的免疫水平，机体防御病害的能力得到提高，但SOD 活性在相应时期被抑制。这与李赫测得的血清中两种酶活性的变化趋势相同，分析可能是因为某些细胞受损会使胞内酶释放入血，所以血清中的酶活性会升高。

溶菌酶主要由单核细胞和粒细胞产生，不仅能水解革兰氏阳性细菌细胞壁中的粘肽，破坏和消除侵入体内的异物，还可改善和增强巨噬细胞的消化功能，增强机体抵抗力[17]。鱼类不同组织中的溶菌酶（LZM）不仅在表达量上有差异，活性也有差异。LZM 广泛分布在整个身体中。大马哈鱼（Oncorhynchus keta）血清、分泌物、黏膜和富含白细胞的组织（主要是肾和肠）中均能检测到溶菌酶。何晟毓等[18]对大口黑鲈（Micropterus salmoides）免疫诺卡氏菌灭活疫苗，第7 d 其溶菌酶活力达到峰值，表明诺卡氏菌灭活疫苗可明显增强大口黑鲈溶菌酶活力。但在本实验中免疫组与对照组相比无显著差异，分析原因是肝脏中LZM 的含量少，影响较小。

免疫基因的表达被作为评价疫苗效果的指标之一。Toll 样受体（TLR）是无脊椎动物和脊椎动物中存在的单个非催化跨膜模式识别受体PRR[19]。TLR2 可以识别并对特定的革兰氏阳性菌均能产生强烈反应，现已有大量研究证实该结论。将革兰氏阳性枝杆菌（Mycobacterium）感染斑马鱼（Danio rerio）后，TLR2 的表达量有显著的变化[20]；乌鳢感染诺卡氏菌后，脾脏和头肾中两个TLR 受体基因表达均上调，且在感染后的96 h、144 h 呈持续上调；Byadgi 研究结果与其相似，诺卡氏菌感染大口黑鲈后TLR2 通路被激活[21]。

MyD88 是最先被发现的TLR 通路中的下游分子与TLR2 均为TLR 通路中的关键因子，不断经过信号的传导，最终针对不同的病原产生不同的免疫应答，两者的表达量上和变化趋势较为相似。本研究中TLR2 在肾脏、脾脏和肝脏中的表达均有显著性升高；MyD88 转录量在各组织中都明显上升，在肾脏中第14 d 转录量达到最高峰，脾脏中最高值出现在第21 d，肝脏中最高值出现在第1 d，表明MyD88 与TLR2 在不同组织及不同免疫时间表达不同。

TLR3 在鱼类免疫系统调节中向T 细胞提供外源抗原，可以识别入侵病原体和激活先天免疫[22]。Tan 等[23]研究证明0.2%～1%益生元的三七提取物能够显著提高珍珠龙胆石斑鱼肝脏内的TGF-β 和TLR3 的表达量。吴越等研究表明，甘露寡糖可以显著提高TLR3 以及IL-8 在石斑鱼肠道内的表达；菊粉和甘露寡糖可以显著提高石斑鱼头肾中TLR3 的表达[24]。本研究结果显示，TLR3 在头肾、肝脏、脾脏中表达上调，说明该口服疫苗对免疫基因的上调中起重要作用，可能增强石斑鱼的先天免疫力。

IL-12p40 可能在引发免疫应答中起到重要作用。张璐等[25]检测发现，IL-12p40 在肾中的表达最高，在脑、鳃、心和肝等组织中表达量较低，表明IL-12p40 在抵御细菌侵染中起一定作用。本实验中，第一次口灌后头肾中的表达量显著性上升，为对照组的9.3 倍，到第一周期免疫结束后保持一个较为稳定的状态，但在脾和肝中表达量较低。

TNF-α 作为免疫系统中重要的免疫细胞因子之一，在机体被感染后，可调控不同免疫途径，介导其他细胞因子的合成及释放，以及细胞的凋亡，在鱼类的免疫反应中承担重要作用[26]。Tanekhy 等[27]将诺卡氏菌浸泡感染牙鲆（Paralichthys olivaceus）2 h 后，头肾和脾脏中TNF-α 基因的表达量显著增加，在24 h 后显著降低。在本实验中，TNF-α 均能在脾脏中高表达，在头肾中表达量低于其他组织。TNF-α 在第一次口灌免疫后迅速上升，为对照组的117 倍，这种表达趋势可能与它是前炎性细胞因子有关，揭示了它在机体开始发生炎症反应中的关键作用。TNF-α 表达量的急速上升对于鱼体迅速做出反应、抵御病原入侵具有重要意义，这些结果与先前的研究结果相似，即TNF-α 在早期表达显著。

MHC 是一组能够编码主要组织相容性系统的基因群，其编码产物广泛参与免疫反应。在适应性免疫中，MHC 处于中心位置[28]，能结合抗原并呈递给T 淋巴细胞，刺激机体产生免疫反应。Yu 等研究表明，健康大黄鱼MHC II 基因在肾、肠、鳃和脾表达较强，在肝和肌肉中表达量最弱，注射细菌疫苗24 h后，肾、肠和脾的相对表达量发生了很大变化[29]。哈维氏弧菌（V.harveyi）灭活疫苗浸泡免疫斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）后，MHCⅡ在鳃、脾、前肾中的相对表达量显著高于对照组[30]；牙鲆注射爱德华氏菌疫苗后，脾脏中MHCⅠ、MHCⅡ均上调表达但MHCⅡ表达水平较高[31]。本研究中，免疫刺激后，MHCⅡ在各组织中均上调，脾中表达较强，但其原因与机理有待进一步研究。

IgM 主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞分泌合成，主要参与先天免疫和体液免疫的调控。接种疫苗可提升鱼类肝脏、脾脏、头肾、胸腺组织中IgM 高表达，但表达强度与组织器官类型相关[32,33]。Nayak等[34]把亚灭活和灭活（抗原形式）的诺卡氏菌（1.2×106CFU/mL）注射进银鲫腹腔内，3 d 后银鲫的脾和头肾中CD8α（＋）T 细胞百分比明显提高，血液中IgM抗体数量也明显增加，接种15 d 后银鲫体内抗体水平达最高，随后下降，存活率分别为62.5%和75.0%。本实验结果表明，口服疫苗免疫后，实验组与对照组相比各组织IgM 的表达水平均提升，头肾、脾脏、肝脏均在免疫后第2 d 达到峰值，IgM 表达量与组织差异相关。本研究中，口服疫苗使石斑鱼头肾、脾脏、肝脏组织中TLR2、TLR3、MyD88、TNF-α、IL-12p40、MHCII 和IgM 的表达部分显著上调也存在显著性下调，不同组织间表达量存在差异，说明制备的口服疫苗有效地引起了免疫反应，且大部分基因参于了免疫应答。