星状神经节离断对脊髓损伤大鼠中枢性疼痛行为及CREB SGK1 NF-κB蛋白表达的影响

邓莉丽 毛冬梅 廖泽青 姚 旌

1）贵州医科大学研究生院，贵州 贵阳 550004 2）贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是指因创伤、炎症、肿瘤或其他原因造成脊髓结构和功能受损，导致运动、感觉和自主神经功能障碍［1-2］。据统计，SCI年发病率（15～40）/1 000 000 人，跌倒和道路伤害是其主要原因［3］。SCI 给患病家庭带来巨大的经济负担，常引起顽固性中枢神经痛（central pain，CP），严重影响患者生活质量及感觉运动功能的恢复。星状神经节离断已在临床应用近一个世纪，用于治疗多种疾病，包括复杂的局部疼痛综合征和外周血管疾病［4］。研究报道，星状神经节离断可缓解中枢神经系统病变造成的顽固性疼痛［5］。关于星状神经节离断对SCI的影响研究鲜有报道，其具体作用机制也尚不清楚。最新研究发现，在SCI构建的大鼠中枢性疼痛模型中，脊髓丘脑束神经元中的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）被激活，而脊髓丘脑束神经元是将疼痛传递到脊髓上区域的投射神经元，表明SCI 后的CP 与CREB激活有关［6］。同时，Xu等［7］发现白藜芦醇可通过抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路改善SCI。血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1（serum and glucocorticoid-inducible kinase 1，SGK1），对于CREB、细胞功能、离子通道和膜转运蛋白、NF-κB 及许多其他重要转录调节因子水平均具有重要调节作用［8］，Yasukochi 等［9］发现，抑制脊髓中的SGK1 可减轻小鼠神经性疼痛超敏反应。本研究旨在探究星状神经节离断对SCI 大鼠中枢性疼痛行为及CREB、SGK1、NF-κB蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性SD 大鼠（200～250 g）购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SYXK（黔）2018-0001，实验方案经本院动物伦理委员会审核通过。

1.2 主要试剂白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE2）试剂盒购自上海莼试生物技术有限公司；CREB、SGK1、NF-κB p65、GAPDH 抗体购自Abcam；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Megafuge™8 小型台式系列离心机购自赛默飞世尔科技公司。

1.3 造模及分组将SD 大鼠按随机分配原则分成假手术组（Sham 组）、模型组（Model 组）、治疗组（Treat 组），各6 例。Model 组、Treat 组大鼠构建SCI模型，大鼠参考文献［10］的方法构建SCI 模型，将大鼠麻醉后，沿着背部皮肤进行1 cm的中线切口，并对脊椎T10水平区域上的肌肉层进行钝性解剖，以暴露T10脊椎椎板，随后进行T10椎体背侧椎板切除术，将薄铁片放置在脊髓上，10 g 的铁球（直径2.5 mm）从10 cm 的高度自由下落，导致脊髓严重挫伤，然后缝合肌肉和皮肤，术后3 d 使用头孢呋辛钠预防感染。在损伤后7 d 内每天行2 次手动辅助膀胱排尿，直至重新建立膀胱反射。根据BBB 运动功能评分、机械痛阈试验和热痛阈试验判断SCI 模型是否构建成功。Sham 组未使用铁球砸脊髓，其他步骤相同。Treat 组大鼠在构建SCI 模型后，在颈部正中剪一切口，观察到梭型的颈上神经节位于右侧颈总动脉的分叉处背侧面，在其斜向外下方约3 mm处可见一个淡黄色团块，即为颈交感神经干（右星状神经节），在近心端将其离断，最后消毒、缝合伤口［11］。

1.4 运动功能学评价所有大鼠在造模结束2 周后均参照BBB 运动功能评分进行双盲测量评分。0～7分可评判双下肢各个关节的活动，8～13 分可观察双下肢步态是否协调，14～21 分主要评判运动中爪的精细动作水平（评分标准：正常状态评分为21 分，后肢瘫痪评分为0 分）。实验动物置于100 cm×100 cm的开放区域内进行，观察大鼠双下肢肢体活动，对其进行评分。

1.5 机械痛阈试验和热痛阈试验首先将大鼠置于透明箱子内适应30 min，随后用一根vonfrey 细丝从2.0 g 的压力值垂直刺激大鼠右后脚足底中部皮肤，逐渐增加压力值，当大鼠出现抬足和舔足行为时，继续测试3 次，刺激间隔3 min，记录此时的刺激强度，即为机械缩足反射阈值（paw withdrawal threshold，PWT）。

将大鼠置于温度50～51 ℃的热平板上，当大鼠出现抬足和舔足行为时，记录产生此行为的最短时间即为热缩足潜伏期（paw withdrawal latency，PWL），每只大鼠测试3次，间隔3 min。

1.6 样本采集在进行运动功能学评价以及机械痛阈试验和热痛阈试验后，对各组大鼠进行取材。大鼠麻醉成功后通过腹主动脉采取3 mL 血液，随后迅速取出T10损伤节段脊髓大约6 mm，均分为2段，一段固定在4%多聚甲醛进行HE染色、TUNEL染色；一段用于Western Blot试验。

1.7 ELISA 法检测血清炎性因子和致痛因子水平取收集的血液应用赛默飞世尔科技公司的Megafuge™8小型台式系列离心机以4 500 r/min的速度离心获得上清液，参照试剂盒检测IL-1β、TNF-α、PGE2水平。

1.8 HE染色检测脊髓组织病理变化取固定在4%多聚甲醛的脊髓组织用梯度乙醇在脱水机中脱水，随后将蜡浸泡过的组织嵌入包埋机中，将修剪好的蜡块放在石蜡切片机上制备4 μm的切片，将石蜡切片脱蜡至水后苏木素-伊红染色，脱水封片，最后在显微镜下镜检采集图像分析脊髓组织病理变化。

1.9 TUNEL 染色检测细胞凋亡取各处理组石蜡切片，将切片经脱蜡后置于乙醇溶液中，随后将玻片置于4%多聚甲醛孵育15 min，去除残液后置于PBS孵育15 min，每个样本滴加100 μL浓度20 g/mL的蛋白酶K溶液，用PBS冲洗3次后加入DAPI染色，在荧光显微镜下成像，并计数细胞凋亡数量。

1.10 Western Blot 检测CREB、SGK1、NF-κB p65通路蛋白表达取脊髓组织研磨后加入RIPA 裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度后，经凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，加入一抗CREB（1∶2 000）、SGK1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶2 000）和GAPDH 抗体（1∶1 000），4 ℃过夜，TBST洗涤后加入二抗，TBST洗膜，加ECL曝光显色，凝胶成像系统分析目的蛋白，ImagJ软件计算蛋白灰度值。

1.11 统计学分析采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，数据在进行正态分布和方差齐性检验后以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析多组间数据，SNK-q 检验比较2 组间数据。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察和运动功能学评估与Sham 组相比，Model组大鼠BBB运动功能评分、PWT、PWL值显著下降（P＜0.05）；与Model 组相比，Treat 组BBB 运动功能评分、PWT、PWL值显著升高（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 星状神经节离断对大鼠BBB运动功能评分、PWT、PWL值的影响Figure 1 Effect of stellate ganglion transection on BBB motor function score，PWT，and PWL values in rats

表1 各组大鼠星状神经节离断后的BBB运动功能评分、PWT、PWL值 （±s）Table 1 BBB motor function scores，PWT，and PWL values of rat stellate ganglion transection in each group （±s）

表1 各组大鼠星状神经节离断后的BBB运动功能评分、PWT、PWL值 （±s）Table 1 BBB motor function scores，PWT，and PWL values of rat stellate ganglion transection in each group （±s）

组别Sham组Model组Treat组BBB运动功能评分/分20.37±2.13 5.12±0.54 10.49±1.21 PWT/g 17.76±1.19 7.84±0.79 10.17±1.10 PWL/s 14.65±2.34 6.34±0.68 8.87±0.90

2.2 星状神经节离断对大鼠炎性因子及PGE2 的影响由图2 可知，与Sham 组相比，Model 组大鼠IL-1 β、TNF-α、PGE2 水平显著升高（P＜0.05）；与Model 组相比，Treat 组IL-1β、TNF-α、PGE2 水平显著降低（P＜0.05）。

图2 星状神经节离断对大鼠炎性因子及PGE2的影响Figure 2 Effect of stellate ganglion disconnection on inflammatory factors and PGE2 in rats

2.3 脊髓组织病理形态学观察HE 染色显示，Sham 组大鼠脊髓组织结构形态完好，细胞呈正常形态，神经纤维分布均匀且行走规则。与Sham 组相比，Model 组脊髓组织及细胞完整性破坏严重，形成大量空洞，神经纤维排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润。与Model 组相比，Treat 组脊髓组织结构形态明显改善，脊髓组织空洞化有所好转，炎性细胞浸润也减少，神经纤维排列趋于正常。见图3。

图3 各组HE染色结果（×200）Figure 3 HE staining results of each group（×200）

2.4 星状神经节离断对脊髓组织神经细胞凋亡的影响与Sham组相比，Model组脊髓组织中细胞凋亡数量明显增加（P＜0.05）；与Model组相比，Treat组脊髓组织中的细胞凋亡数量明显减少（P＜0.05）。见图4～5。

图4 TUNEL染色检测细胞凋亡（×200）Figure 4 TUNEL staining for detecting cell apoptosis（×200）

图5 各组大鼠脊椎组织细胞凋亡数量比较Figure 5 Comparison of the number of apoptotic cells in spinal tissue of rats in each group

2.5 星状神经节离断对脊髓组织CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白表达水平的影响由图6～7 可知，与Sham 组相比，Model 组大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与Model 组相比，Treat 组CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平显著下降（P＜0.05）。

图6 各组大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白表达比较Figure 6 Comparison of CREB, SGK1, NF-κ B p65 protein expression in each group

图7 各组大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白表达比较Figure 7 Comparison of CREB, SGK1, NF-κB p65 protein expression in each group

3 讨论

SCI主要症状为感觉丧失或损害，损伤的相关继发性后果是慢性神经性疼痛［12］。约50%的SCI 患者会出现使人衰弱的CP，但尚无有效的治疗方法。脊髓损伤后的CP 严重影响患者的健康状况和生活质量［13］。因此，迫切需要寻找有效、安全和新颖的疗法［14］。星状神经节离断在临床上已应用十分广泛，常用于治疗各种疼痛综合征，如慢性区域疼痛综合征Ⅰ型和Ⅱ型、疱疹后神经痛、颈肩臂综合征、神经性疼痛［15］。Chaudhary等［16］发现，在颈椎手术期间星状神经节离断可减轻CP。本研究参考既往文献构建SCI 模型，结果发现Sham组大鼠脊髓组织结构形态完好，细胞呈正常形态，神经纤维分布均匀且行走规则，与Sham 组相比，Model 组脊髓组织及细胞完整性破坏严重，形成大量空洞，神经纤维排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润，BBB 运动功能评分、PWT、PWL 值显著下降，表明模型构建成功。星状神经节离断治疗后脊髓组织结构形态明显改善，脊髓组织空洞化有所好转，炎性细胞浸润减少，神经纤维排列趋于正常，BBB 运动功能评分、PWT、PWL值显著增加，暗示星状神经节离断可能对SCI诱导的CP起到改善效果。

研究报道，急性SCI 早期阶段会促进IL-1β和TNF-α等多种促炎性细胞因子的释放，促使大部分小胶质细胞呈促炎M1 型转化，同时聚集于SCI 部分，分泌更多的炎性细胞因子，通过形成级联瀑布效应进一步加重局部炎症反应，从而造成CP［17］。Song 等［18］发现，通过增加SCI 大鼠PGE2 水平可介导星形胶质细胞炎症反应。本研究显示Model 组大鼠IL-1β、TNF-α、PGE2水平显著升高，而星状神经节离断处理后IL-1β、TNF-α、PGE2 水平显著下降，表明星状神经节离断可能通过抑制IL-1β、TNF-α、PGE2的释放减轻炎症反应及疼痛，进而对SCI 诱导的CP起改善效果。细胞凋亡又称“程序性细胞死亡”，Sun等［19］报道，可通过抗炎和抗细胞凋亡机制减轻家兔脊髓缺血再灌注损伤。抑制细胞凋亡可对SCI 大鼠发挥神经保护作用［11］。Turtle等［20］也发现，SCI 引起的疼痛可能与细胞凋亡有关。本研究显示，Model 组大鼠细胞凋亡数量显著升高，而星状神经节离断处理后细胞凋亡数量显著减少，表明星状神经节离断可能通过抑制细胞炎症以及细胞凋亡发挥治疗SCI 大鼠中枢性疼痛的作用。

SGK1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC亚家族的成员，阻断SGK1可显著减弱疼痛反应和病理性疼痛的发展。SGK1 在各种类型病理性疼痛的发展中发挥重要作用，且靶向SGK1可能是一种新的疼痛管理治疗策略［21］。此外，SGK1 可影响转录因子，如CREB、NF-κB p65，并参与炎症因子和激素的分泌、神经兴奋性、细胞增殖和凋亡、细胞代谢等多种生物过程［8，22］。Xiao 等［23］发现SGK1 通过调节NF-κB p65蛋白水平提高吗啡诱导的大鼠镇痛耐受。本研究发现Model组大鼠CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白水平显著升高，而星状神经节离断治疗后CREB、SGK1、NF-κB p65蛋白水平显著降低，表明星状神经节离断可下调CREB、SGK1、NF-κB p65 蛋白水平以及减轻SCI大鼠中枢性疼痛。

星状神经节离断可下调SGK1、CREB、NF-κB p65表达，减轻炎症反应以及疼痛，对SCI大鼠中枢性疼痛起改善作用。本文不足是关于机制方面的研究较浅，下一步将深入研究以完善。