贵州苗族红酸汤对高脂饮食诱导型大鼠非酒精性脂肪肝的预防作用*

王乃经, 陈云云, 陈莎, 唐扩, 王惠群*

(贵州医科大学 公共卫生与健康学院 环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 561113)

发酵食品在人类饮食文化中已有数千年的历史,诸多研究发现发酵食品中含有丰富的对人体健康有益的生物活性成分,如降压肽、抗氧化肽、抑菌肽等,发挥辅助治疗高血压、清除自由基等作用[1]。日本国立癌症研究中心提出大豆发酵类食品能减低心血管疾病患者死亡的风险[2],美国斯坦福大学一项研究指出发酵食品可以通过调节肠道菌群减轻人体炎症反应[3]。基于发酵食品潜在的健康效应,一些组织已建议将发酵食品纳入国家膳食推荐指南[4]。苗族红酸汤在贵州省具有数百年的食用历史,是贵州省民族特色发酵食品。红酸汤以番茄、红辣椒和木姜子作为主要原料,经微生物自然发酵后形成了一个完整的生物系统。发酵是决定红酸汤酸度和风味成分的关键,主要分为两步:第一步是将番茄和红辣椒剁碎后密封于坛内发酵成半成品,第二步是在半成品中加入一定比例的木姜子和生姜等辅料经乳酸菌二次发酵。最终制成的红酸汤富含多种生物活性物质,既保留了原有的番茄红素和辣椒碱,又形成了乙酸乳酸等风味成分[5],其中番茄红素和辣椒碱具有抗氧化、降低胆固醇、改善血脂和减轻炎症的作用[6-7],而有机酸具有抑菌、消炎和抗氧化等作用[8]。上述研究提示红酸汤作为一种富含多种复杂组分的发酵食品,在预防和治疗脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)等疾病时具有价值。近年来多项研究表明,过量的脂肪摄入会增加机体罹患NAFLD和糖尿病的风险[9-11]。NAFLD是指不饮酒或少量饮酒人群的肝细胞脂肪变性和脂肪积聚而引起的一种临床常见的慢性疾病,是威胁人民健康的三大肝病之一[12]。目前,有学者针对NAFLD 的发病机制提出了“二次打击”学说:“一次打击”即在高脂饮食诱导下体内游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)和甘油三酯(triglyceride,TG)不断增多引起肝脏脂肪积聚,导致肝细胞脂肪变性;“二次打击”是在此基础上诱发肝脏炎症和线粒体功能障碍,并加重氧化应激,最终导致肝细胞受损和脂肪性肝炎[13-14]。研究表明,若不及时干预NAFLD,炎症持续存在会造成肝细胞坏死严重,进而发展为肝硬化和肝癌。目前尚没有治疗NAFLD的有效药物[15],主要是以祛除诱因、调整饮食及减轻体质量为主。因此,利用某些天然食物、发酵食品及其有效成分来调控血脂代谢,进行体重管理是未来防治NAFLD的发展趋势[16-18]。本文用贵州苗族红酸汤对高脂饮食诱导型大鼠NAFLD进行干预,探讨苗族红酸汤对NAFLD的预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1材料 苗族红酸汤(食品许可证号SC1245226350006,购自贵州玉梦食品有限公司);基础饲料由贵州医科大学动物实验中心提供,其成分包括粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、粗水分及微量元素和氨基酸等;高脂饲料由78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油及0.2%胆盐组成。

1.1.2实验动物 无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性SD大鼠,6周龄,体质量(160±20)g,共30只,由贵州医科大学实验动物中心提供,许可证号为SCXK(辽)2020-0001。本次动物实验在贵州医科大学实验动物中心进行,已获得贵州医科大学实验动物伦理审查委员会批准(伦理审批号NO.2100228)。实验环境:环境温度(25±5)℃,相对湿度55%,明暗交替周期12 h/12 h,保持良好通风。

1.1.3主要试剂与仪器 总抗氧化能力(total antioxidant capability,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;10%多聚甲醛、苏木精染料、伊红染料、改良油红O染色液购自上海麦克林生物有限公司。TDL-5000bR台式高速离心机购自上海安亭仪器厂;Multiskan GO超级酶标仪、HPX-9162MBE恒温孵育箱购自美国Thermo Scientific公司;HD-F2600全自动血生化分析仪购自济南汉方医疗器械有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1抗氧化成分含量检测 番茄红素检测按照GB/T 22249-2008《保健食品中番茄红素的测定》[19],辣椒碱检测按照GB/T 30389-2013《辣椒及其油树脂 总辣椒碱含量的测定 分光光度法》[20],有机酸检测按照GB 5009.157-2016《食品有机酸的测定》[21]。

1.2.2贵州苗族红酸汤的制备和灌胃剂量 将苗族红酸汤和水按质量比 4∶1 稀释,稀释后的红酸汤加热至沸腾,冷却后过滤收集滤液备用。经过前期人群摄入苗族红酸汤的调查和《实验动物学》的换算关系[22],本次实验酸汤灌胃剂量定为根据体质量按照8 g/kg给予。

1.2.3实验动物分组及干预 实验动物分组:30只6周龄雄性SD大鼠适应性喂饲基础饲料1周后,按照体质量随机分为酸汤组、模型组和正常组(每组10只)。酸汤组喂饲高脂饲料,同时根据体质量按照8 g/kg灌胃苗族红酸汤;模型组喂饲高脂饲料,灌胃同等体积的蒸馏水;正常组喂饲普通饲料,灌胃同等体积的蒸馏水。干预方式和时间:每日下午3时,以灌胃方式对3组大鼠连续干预12周,每次灌胃前称取大鼠体质量,其余时间动物可自由摄食及饮水。

1.2.4实验动物解剖和取材 实验干预12周末,所有大鼠禁食12 h,并称量体质量,腹腔注射1%的戊巴比妥钠进行麻醉,心尖取血并保存在非抗凝的生化管中,常温静置10～20 min后,3 000 r/min离心15 min,取血清分装,-80 ℃冷冻保存。剥离大鼠肝脏后称重,并用生理盐水漂洗,切取完整的一叶肝脏浸泡在10%多聚甲醛进行固定。

1.2.5肥胖指数(Lee's指数)和肝脏指数的计算 将记录的大鼠体质量、身长及肝脏质量代入下列公式计算,Lee's指数(%)=体质量(g)1/3×103/身长(cm),肝脏指数(%)=肝脏质量/体质量×100% 。

1.2.6血清血脂四项和肝功能检测 取400 μL血清用全自动血生化分析仪测定大鼠血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量。

1.2.7血清T-AOC、MDA、TNF-α和IL-6检测 取血清按照对应试剂盒说明书中蛋白浓度测定步骤依次加入标准品、待测样品和BCA工作液,于37 ℃恒温箱孵育30 min,用酶标仪设置波长562 nm处测量各孔吸光度,根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.8肝脏苏木素-伊红染色(HE染色)和油红O染色 用10%多聚甲醛固定肝组织,一部分经脱水、包埋、切片、HE染色、脱水后显微镜观察肝组织病理变化;一部分经脱水、透明、冰冻固定、切片、复水、苏木素染色、分化、反蓝、0.5%伊红染色、脱水后显微镜观察肝组织脂质沉积情况;一部分组织经脱水、包埋、切片、滴加50%油红O染色液染色、清洗、苏木素染色、清洗、65%甘油封片后显微镜观察肝组织脂质沉积情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 贵州苗族红酸汤抗氧化成份的含量

苗族红酸汤含有多种抗氧化成份,包括番茄红素、辣椒碱、乳酸和乙酸,各种抗氧化成分的含量见表1。

表1 贵州苗族红酸汤抗氧化成份的含量Tab.1 The antioxidant contents of antioxidant components of Guizhou Miao red sour soup

2.2 贵州苗族红酸汤对大鼠体质量、摄食量、Lee's指数和肝脏指数的影响

各组大鼠体质量在实验开始干预前无差异(P>0.05);经12周干预后,模型组体质量高于酸汤组和正常组大鼠(P<0.05),且酸汤组和正常组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05),提示红酸汤可以有效抑制高脂饮食诱导的大鼠体质量增加;模型组大鼠的Lee's指数和肝脏指数高于酸汤组和正常组(P<0.05),提示红酸汤能降低高脂饮食导致的大鼠体内脂肪积聚;在干预期间,正常组、模型组和酸汤组大鼠摄食量无差异(P>0.05),提示红酸汤没有抑制酸汤组大鼠摄食量进而影响实验结果。见图1。

注：(1)与正常组比较,P<0.05; (2)与模型组比较,P<0.05。

2.3 贵州苗族红酸汤对大鼠血脂四项水平的影响

红酸汤可降低酸汤组大鼠血清TG、TC、LDL-C含量,同时升高血清HDL-C含量(P<0.05),提示红酸汤具有预防高脂饮食导致的大鼠血脂紊乱的可能。见图2。

注：(1)与正常组比较,P<0.05; (2)与模型组比较,P<0.05

2.4 大鼠肝功能ALT和AST水平

模型组大鼠的血清ALT和AST水平高于酸汤组和正常组(P<0.05),提示红酸汤具有预防高脂饮食诱导的大鼠肝功能损伤的可能。见表2。

表2 贵州苗族红酸汤对大鼠肝功能的影响Tab.2 Effect of Guizhou Miao red sour soup on liver function of

2.5 大鼠血清T-AOC、MDA、TNF-α和IL-6含量

由表3可知,红酸汤可以升高酸汤组大鼠血清T-AOC含量,并降低MDA水平(P<0.05),提示红酸汤具有预防机体氧化应激,提高抗氧化能力的可能。与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α和IL-6含量升高,经红酸汤干预后酸汤组大鼠TNF-α和IL-6含量下降(P<0.05),提示红酸汤具有预防高脂饮食诱导型大鼠NAFLD慢性炎症的可能。

表3 贵州苗族红酸汤对大鼠氧化应激和炎症因子的影响Tab.3 Effect of Guizhou Miao red sour soup on oxidative stress and inflammation levels of

2.6 贵州苗族红酸汤对大鼠肝脏脂质沉积的影响

肝组织HE染色结果显示,正常组大鼠的肝细胞圆润、饱满,肝板排列规则、整齐,肝窦无明显扩张或挤压,未见明显异常;模型组大鼠的肝脏广泛可见肝细胞脂肪变性、胞质内可见大小不一的圆形空泡;酸汤组大鼠肝脏有少量肝细胞轻度脂肪变性,胞质内可见微小的圆形空泡。油红O染色结果显示模型组大鼠肝脏有大量红色脂肪滴,而酸汤组和正常组大鼠只有少量红色脂肪滴,提示贵州苗族红酸汤能有效改善高脂饮食诱导下大鼠肝脏脂质沉积。见图3。

图3 各组大鼠肝脏组织学特征Fig.3 Histological characteristics of the rat liver in each group

3 讨论

肝脏在维持机体代谢和内环境的平衡方面起着重要作用,肝功能失调可能会导致代谢性疾病[23],而脂质代谢参与了NAFLD的发展,若不及时干预,该疾病有可能发展为脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝癌[24]。NAFLD的发生往往伴随着肝细胞脂肪变性、脂质积聚和机体氧化应激、慢性炎症的现象。因此,本研究首先通过对贵州苗族红酸汤的抗氧化成分进行检测,发现番茄红素、辣椒碱、乳酸和乙酸的含量较为丰富。然后本研究以高脂饮食诱导的NAFLD肥胖大鼠为研究对象,用贵州苗族红酸汤进行干预后结果显示,酸汤组大鼠的体质量、Lee's指数及肝脏指数较模型组大鼠均降低,提示进行酸汤干预后能够预防大鼠体内的脂肪蓄积。干预期间,正常组大鼠、酸汤组大鼠及模型组大鼠在每日平均摄食量上无差异,提示红酸汤并不是通过抑制大鼠食欲导致能量摄入减少从而发挥减轻体质量和减少脂肪生成的作用。说明贵州苗族红酸汤对高脂饮食诱导型NAFLD具有一定的预防作用。

高脂饮食导致的NAFLD往往会伴随着机体脂质代谢紊乱,研究表明,血清LDL-C能输送TC至血液,HDL-C则是能运载血液中TG、TC向肝脏运输,转化为胆汁酸,促进胆固醇代谢,从而稳定血脂水平[25],而长期摄入过量饱和脂肪酸和胆固醇会导致机体血脂代谢负荷增加,引发血脂紊乱[26]。在本实验中,酸汤组大鼠血清TG、TC、LDL-C和AST及ALT水平较模型组降低,同时HDL-C水平增高,提示红酸汤干预能够预防高脂饮食诱导的NAFLD大鼠血脂紊乱和肝功能受损。HE染色和油红O染色结果显示,酸汤组大鼠肝脏脂肪变性不明显,圆形空泡和红色脂肪滴数量较少,说明红酸汤可以有效预防NAFLD大鼠肝脏脂肪变性和脂质沉积的现象,改善大鼠机体内脂代谢紊乱。

高脂饮食后能量摄入过剩导致脂质代谢紊乱,机体内会产生氧化应激。肝脏脂肪变性是NAFLD发病的重要机制,上述结果说明红酸汤可能有效干预了NAFLD的“一次打击”,从而缓解NAFLD的发生。值得注意的是,持续性高热量饮食会加重脂肪细胞内TG沉积,造成细胞氧化应激,脂肪细胞中 TNF-α 和IL-6等炎症因子分泌发生改变,造成慢性炎症症状[27-28]。T-AOC是反应细胞内抗氧化能力总和的指标,一定程度上反映机体清除活性氧/一氧化氮合酶的能力;MDA 是脂质过氧化的终端产物,提示体内氧化应激程度,过量累积会对机体产生毒性[29]。TNF-α和IL-6是典型的炎症因子[30-31],TNF-α可以抑制胰岛素的信号转导,引起血糖升高。长期摄入高脂饮食时脂肪组织可以分泌大量IL-6,而IL-6可以促进脂肪分解,升高FFA,并抑制胰岛素肝糖原代谢从而引起胰岛素抵抗,最终导致肥胖、动脉粥样硬化和NAFLD等疾病。红酸汤干预后,与模型组比较酸汤组大鼠血清T-AOC水平升高,MDA水平降低,并且酸汤组较模型组大鼠血清TNF-α和IL-6含量降低,说明红酸汤能提高大鼠抗氧化能力和抗氧化酶活力,清除脂质过氧化产物,预防大鼠机体氧化应激,并且能够减轻机体慢性炎症。提示红酸汤可能有效干预了NAFLD的“二次打击”,预防机体氧化应激和慢性炎症,从而缓解NAFLD的进一步发展。

综上所述,本研究通过高脂饮食诱导NAFLD,在喂养高脂饮食的同时用贵州苗族红酸汤进行干预,结果提示苗族红酸汤对NAFLD有一定的预防作用,可能与其调节血脂紊乱、改善肝脏脂肪变性和脂质沉积、减轻机体氧化应激和慢性炎症有关。