环状RNA MAPK4通过吸附miR-125a-3p对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响*

郝建强, 何森, 谢飞, 张文彦, 叶勇强

(资阳市中心医院 神经外科, 四川 资阳 641300)

神经胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤疾病之一,其病例占原发颅内肿瘤的27%以上,具有发病率高、预后差和死亡率高的特点[1]。目前治疗神经胶质瘤方式主要包括放疗、化疗、手术和靶向治疗等,但患者的具体治疗方案还需要根据患者自身的精神状态、治疗的预期结果、肿瘤病变部位以及病变的严重程度等众多因素进行综合考虑[2]。虽然目前已有的治疗方式可以改善一部分神经胶质瘤患者的预后和提高患者的生存期,但是仍有部分患者的治疗效果欠佳。分析神经胶质瘤的发病机制对指导神经胶质瘤靶向药物研究、设计均有重要意义。神经胶质瘤是脑胶质细胞癌变所致,其发病与基因突变、表观遗传学变异有关,基因、蛋白异常表达受到多种因子调节,例如环状RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等[3-4]。circRNA是由外显子或内含子经选择性剪切产生的一类非编码RNA,具有较高的稳定性、保守性、组织特异性及高丰度等特点,可在组织中稳定性表达,还可参与不同疾病发生、进展过程,其中包括恶性肿瘤[5]。有研究表明环状RNA MAPK4(circular RNA MAPK4,circ-MAPK4)在神经胶质瘤组织中表达上调[6],推测其可能参与神经胶质瘤的发生过程,但其作用机制尚未阐明。因此,本研究基于生物信息数据库、神经胶质瘤细胞体外实验来初步探讨circ-MAPK4对神经胶质瘤细胞生物学行为的影响及其潜在作用机制,希望能为神经胶质瘤的靶向药物研究、设计提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 人神经胶质瘤细胞株(U138、U373、U87、A172和U251)和人正常性星形胶质细胞(HA1800)均由中国典型培养物保藏中心提供。

1.1.2主要试剂和仪器 1%青霉素/链霉素、Trizol提取试剂盒、V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen,circ-MAPK4 siRNA、siRNA-NC和miR-125a-3p inhibitor、NC-inhibitor、微小RNA-125a-3p(miR-125a-3p)mimics、NC- mimics购自广州市锐博生物科技有限公司,PrimeScriptTMRT Master Mix购自日本Takara,GoTaq®Green Master Mix购自美国Promega,LightCycler®480 SYBR Green I Master购自瑞士Roche,CCK-8细胞活力试剂盒购自美国APExBio,兔抗上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、Ceaved-caspase3、Ki67、cycD、Vimentin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、羊抗兔IgG二抗购自美国Santa Cruz,基质胶、Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司。LightCycler 480荧光定量PCR仪器购自瑞士Roche,ReadMax 1900Plus多功能酶标仪购自上海闪谱生物科技有限公司,BB15 CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific,CytoFLEX LX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 将U138、U373、U87、A172、U251细胞接种于DMEM高糖培养基中进行贴壁生长,细胞培育环境为37 ℃、5%CO2加湿培养箱;HA1800细胞接种至星形胶质细胞培养基生长,培养环境条件与神经胶质瘤细胞相同;待细胞生长融合80%～90%时进行传代培养,取第3代细胞用于后续实验。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)测神经胶质瘤细胞中基因表达水平 使用Trizol试剂盒提取各组细胞系的总RNA,使用PrimeScriptTMRT Master Mix、GoTaq®Green Master Mix进行逆转录扩增,使用LightCycler®480 SYBR Green I Master进行qPCR扩增,扩增条件为95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、75 ℃ 15 s,40个循环,使用2-ΔΔt法计算目的基因表达水平。引物序列:circ-MAPK4,正向引物为5′-ATCAGCACAGAGGACCTCGT-3′, 反向引物为5′-ATCCTCTGGAGCCTTTG GA T-3′; miR-125a-3p,正向引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACG

ACGGCTCCC-3′,反向引物为5′-TGACCACAGGTGAGGTTCTTG-3′;U6,正向引物为5′-CGCTT CGGCAGCACATATAC-3′,反向引物为5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.3细胞转染 以神经胶质瘤细胞中circ-MAPK4表达水平最低的U138细胞作为转染细胞背景,将U138细胞分为circ-MAPK4低表达组(si-circMAPK4组)、阴性对照组(si-NC组)、无转染组(control组),使用Lipofectamine®2000将si-circMAPK4组、si-NC组U138细胞分别转染circ-MAPK4 siRNA及其阴性对照siRNA-NC,control组细胞不做转染处理,使用qPCR检测circ-MAPK4水平。经qPCR验证转染成功后,si-circMAPK4组U138细胞分为2个亚组(circ-MAPK4+miR-inhibitor组、circ-MAPK4+NC-inhibitor组),将miR-125a-3p inhibitor、NC-inhibitor分别转染circ-MAPK4+miR-inhibitor组、circ-MAPK4+NC-inhibitor组细胞,并使用qPCR验证。

1.2.4荧光素酶实验 使用circNet、StarBase分析预测circ-MAPK4与miR-125a-3p的靶向关系和结合位点,使用荧光素酶实验验证circ-MAPK4对miR-125a-3p的靶向调控作用,将circ-MAPK4的全基因(hsa_circ_0047688)插入荧光素酶基因下游,将野生型circ-MAPK4荧光素酶重组载体记为circ-MAPK4-WT,通过点突变构建突变型circ-MAPK4荧光素酶重组载体并记为circ-MAPK4-mut,将circ-MAPK4-WT、circ-MAPK4-mut、miR-125a-3p mimics、NC- mimics共转染至U138细胞,检测荧光素酶活性。

1.2.5CCK-8法检测细胞活力 将U138细胞接种至96孔板(1×103/孔),培养条件同1.2.1,分别在培养第1、2、3、4、5天时加入CCK-8反应溶液37 ℃反应2 h,然后在分光光度计450 nm波长处检测吸光度。

1.2.6细胞集落实验检测细胞增殖能力 将U138细胞接种至培养皿(1×103/孔),轻柔摇动培养皿使细胞能够均匀分布,在1.2.1条件下培养7 d,使用磷酸缓冲液轻柔洗涤2次,甲醇固定细胞10 min,0.1%结晶紫染色10 min,在显微镜下统计细胞克隆数(细胞数>50个),克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.7Transwell检测细胞侵袭能力 将细胞接种至预先涂有Matrigel胶无血清Transwell小室(1×105/孔),下室加入含有血清的培养基,同1.2.1培养条件培养24 h,将下室细胞用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫染色,随机5个不重叠视野,计算其中侵入细胞数目。

1.2.8流式细胞法检测细胞凋亡情况 将U138细胞接种至96孔板(4×105/孔),培养条件同1.2.1培养24 h,收集细胞,加入 Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL 避光反应20 min,上样流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.9Western blot检测蛋白表达 提取细胞总蛋白,采用Bradford调整各组蛋白浓度一致,经10%SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜,密封2 h,加入兔抗人Ki67、cycD、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、Ceaved-caspase3、GAPDH一抗(1∶500)4 ℃ 孵育过夜,漂洗,加入HRP标记二抗(1∶500)孵育1 h,化学发光,凝胶图像处理系统软件分析待测蛋白条带相对灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人神经胶质瘤细胞中circ-MAPK4和miR-125a-3p表达水平

与HA1800细胞比较,U138、U373、U87和A172细胞的circ-MAPK4表达水平升高(P<0.05),miR-125a-3p表达水平下降(P<0.05)。见表1。

表1 神经胶质瘤细胞系和HA1800细胞circ-MAPK4、miR-125a-3p表达水平Tab.1 Expression levels of circ-MAPK4 and miR-125a-3p in glioma cell lines and HA1800

2.2 circ-MAPK4和miR-125a-3p的靶向关系验证

与si-NC组比较,si-circMAPK4组细胞的circ-MAPK4表达水平降低(P<0.05),miR-125a-3p表达水平升高(P<0.05);与circ-MAPK4+NC-inhibitor组比较,circ-MAPK4+miR-inhibitor组细胞miR-125a-3p表达水平降低(P<0.05),见表2。经circNet、StarBase分析预测circ-MAPK4与miR-125a-3p存在靶向关系(图1),荧光素酶实验结果显示circ-MAPK4-mut/miR-125a-3p mimics、circ-MAPK4-mut/NC-mimics、circ-MAPK4-WT/NC-mimics细胞的荧光素酶相对活性均高于circ-MAPK4-WT/miR-125a-3p mimics细胞(F=437.659,P<0.001)。

图1 circ-MAPK4和miR-125a-3p结合位点预测Fig.1 Prediction of binding site between circ-MAPK4 and miR-125a-3p

表2 不同组别细胞circ-MAPK4和miR-125a-3p的靶向关系Tab.2 Targeted relationship between circ-MAPK4 and miR-125a-3p

2.3 circ-MAPK4低表达对U138细胞增殖的影响

与si-NC组比较,si-circMAPK4组细胞活力、克隆形成率、Ki67和cycD蛋白表达降低(P<0.05);与circ-MAPK4+NC-inhibitor组比较,circ-MAPK4+miR-inhibitor组细胞活力、克隆形成率、Ki67和cycD蛋白表达升高(P<0.05)。见图2、表3。

注：(1)与si-NC比较,P<0.05;(2)与circ-MAPK4+NC-inhibitor组比较,P<0.05。

表3 不同组别细胞增殖、Ki67和cycD蛋白表达Tab.3 Cells proliferation and expressions of Ki67 and cycD

2.4 circ-MAPK4低表达对U138细胞侵袭的影响

与si-NC组比较,si-circMAPK4组细胞侵入细胞数目、N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);与circ-MAPK4+NC-inhibitor组比较,circ-MAPK4+miR-inhibitor组细胞侵入细胞数目、N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 circ-MAPK4低表达对U138细胞侵袭的影响(Transwell,×200)Fig.3 Effects of low-expression circ-MAPK4 on invasion of U138 cells (Transwell,×200)

表4 不同组别细胞侵入数目、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达Tab.4 Number of invasion cells and expressions of E-cadherin, N-cadherin, and Vimentin

2.5 circ-MAPK4低表达对U138细胞凋亡的影响

与si-NC组比较,si-circMAPK4组细胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表达升高(P<0.05);与circ-MAPK4+NC-inhibitor组比较,circ-MAPK4+miR-inhibitor细胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表达降低(P<0.05)。见表5。

表5 细胞凋亡率、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表达Tab.5 Apoptosis rate and expression of Ceaved-caspase3/caspase3

3 讨论

神经胶质瘤病变的恶性机率高于其他类型肿瘤,患者的生存期不超过2年,5年生存率低于10%,虽然经手术、放疗、化疗等治疗可增加患者存活率,但胶质瘤细胞的恶性生物学行为易引起患者术后复发或对放化疗产生抵抗作用,不利于延长患者的生存时间[7-8]。神经胶质瘤的恶性生物学行为变化受到多种因素的共同调节。20世纪70年代时,circRNA在RNA病毒中被发现,属于一种特殊的非编码RNA,是前体RNA的3’末端和5’末端首尾相连产生的环状结构,性质稳定、富集高且重复检测性好,还可参与多种疾病发病、进展过程[9]。已有研究[10]表明circRNA-FBXW7表达与胶质瘤患者的总生存期存在正相关,还有学者[11]证实circ_002136表达下调可显著抑制U87细胞的活力、侵袭和血管形成,与调节miR-138-5p表达有关。miRNA是一大类非编码小RNA,经碱基互补配对方式直接作用信使RNA,调节多种基因的转录、翻译过程和参与疾病发生[12]。随着研究深入发现circRNA可充当miRNA分子海绵,对miRNA有吸附、捕获作用并使miRNA不能与其靶向的mRNA结合,从而调节其基因的表达水平[13]。有研究表明circ-TTBK2可通过吸附miR-761靶向调节胶质瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡[14]。最近有研究显示circ-MAPK4在胶质瘤组织中呈明显表达升高趋势[15]。本研究通过比较人神经胶质瘤细胞系和人正常胶质细胞circ-MAPK4表达水平发现,人神经胶质瘤不同细胞系中circ-MAPK4表达水平大致相同,大部分呈现出升高趋势,其中U138细胞系circ-MAPK4表达水平最显著,此结果与上述研究趋势相似,由此推测circ-MAPK4可能参与人神经胶质瘤发病过程。

circRNA可作为miRNA分子海绵,推测circ-MAPK4可能是通过某种miRNA作用发挥其功能,本研究通过circNet、StarBase在线分析预测发现,circ-MAPK4与miR-125a-3p存在结合位点,并且通过荧光素酶实验得到证实,此外还发现U138细胞miR-125a-3p表达水平较HA1800细胞明显降低,说明circ-MAPK4与miR-125a-3p存在靶向关系。神经胶质瘤较其他肿瘤的恶性病变程度高,这与其活跃的细胞恶性生物学行为存在密切关系,肿瘤细胞的恶性生物学行为与其不受控制的细胞增殖、细胞侵袭和细胞凋亡能力降低有关。因此,本次研究为探究circ-MAPK4对人神经胶质瘤细胞的恶性细胞生物学行为的影响,以U138细胞作为神经胶质瘤细胞体外研究背景构建circMAPK4低表达细胞和在此基础上构建miR-125a-3p 低表达细胞系,发现circMAPK4低表达细胞的细胞活力、克隆形成率降低,进一步分析蛋白表达发现Ki67和cycD蛋白表达降低,而在circMAPK4低表达的基础上抑制miR-125a-3p表达可以部分逆转上述指标趋势。Ki67属于细胞增殖抗原,其表达水平高低可展示细胞的增殖情况[16]。cycD是调节细胞周期运行的周期蛋白,其表达水平可以反映细胞增殖情况[17]。已有研究[18]表明miR-125a-3p可以通过抑制cycD等细胞周期相关蛋白表达来抑制结肠癌细胞增殖,本研究结果呈现出相似趋势,说明circMAPK4可能通过吸附miR-125a-3p调节U138细胞增殖过程。

本研究还发现circMAPK4低表达可以降低U138细胞的侵入细胞数目和N-cadherin、Vimentin蛋白表达,但可提高细胞凋亡率和E-cadherin、Ceaved-caspase3/caspase3蛋白表达。肿瘤上皮间质转化增强是引起肿瘤细胞侵袭能力增强的重要原因之一,肿瘤细胞侵袭转移增强会提高肿瘤周边转移风险,N-cadherin、Vimentin在肿瘤细胞侵袭转移中起正调控作用,而E-cadherin在肿瘤细胞侵袭转移中起负调控作用。caspase3是细胞凋亡的执行分子,其切割呈活化状态的分子能不可逆诱导细胞凋亡。有研究[19]显示miR-125a-3p在脑胶质瘤组织中低表达,其过表达可以促进胶质瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖,本研究也呈现出相似趋势,说明circMAPK4可能通过吸附miR-125a-3p调节U138细胞侵袭和细胞凋亡过程。

综上所述,circ-MAPK4低表达可降低人神经胶质瘤细胞U138细胞活力、增殖和侵袭能力,促进细胞凋亡,可能与吸附miR-125a-3p作用有关。