牛白血病的分子诊断与基因治疗

赛丽麦·穆门

摘要：牛白血病是由C型、致瘤病毒群、反转录病毒科、丁型反转录病毒属的牛白血病病毒导致的一种可发生于瘤牛、水牛、普通牛中的疾病，全世界范围内均可发生此病。患病后牛只的生产性能下降，给广大养殖户带来严重的经济损失，因此准确掌握其诊断技术及治疗方案至关重要。本文综述了在分子层面诊断牛白血病的方法以及在基因层面进行治疗的方案，以期广大养殖户能够利用先进的技术减少此病的发生。

关键词：牛；白血病；分子诊断；基因治疗

牛白血病作为一种全世界均流行的、经常发生于各种牛中的慢性、致死性、肿瘤性疾病，其产生的危害极大，奶牛感染之后造成产奶量的下降，肉牛感染之后造成体重的减轻、生长性能的下降。感染此病的牛只的皱胃、右心耳、肠、子宫、肾脏、肺脏、肝脏等均受到侵害，随着病情的发展最终导致牛只免疫功能下降、免疫应答受损，患其他疾病的风险增加。牛白血病的传染源主要为感染牛白血病的动物，此病可以通过垂直（血液、胎盘、乳汁）或者水平传播方式（血液、渗出物、组织的混合物）进行传播，还可以通过昆虫的叮咬（蝇等）进行水平传播。到目前为止，此病仍在世界范围内（波兰、乌克兰、澳大利亚、巴西）广泛分布。我国自1978年首次报道此病之后，截止到2016年，通过对6个省份的奶牛、15个省份的肉牛进行检测，发现牛白血病在奶牛个体、肉牛个体中的阳性率分别为49.1%、1.6%，说明此病在我国养牛场尤其是奶牛场中普遍存在。因此，掌握先进、科学、准确的分子诊断方式是判断此病的基础，而熟悉此病的基因治疗方案至关重要[1]。

1 患病机理

当牛只感染牛白血病病毒后会通过影响牛只外周循环而导致患病，患病牛只颌下淋巴结、腹股淋巴结等多处体表淋巴结发生炎症，随着淋巴细胞的不断恶性浸润和增生，导致其血液系统、淋巴系统受到严重的损伤，接着骨髓组织、内皮系统等也发生病变，随着病毒入侵的蔓延导致胃肠道系统也出现病变，表现为因食道无法扩张而出现吞咽、采食困难等症状，最终衰竭而亡[2]。从分子层面解释为：当牛只感染牛白血病病毒后其病毒的基因会整合在牛只的染色体中，导致牛只终身带毒。在牛只体内反转录酶的作用下，牛白血病病毒合成一条DNA分子链以用于与病毒的RNA进行杂交，在DNA聚合酶的作用下形成具有双股的DNA并进入到细胞核内，以整合到牛只染色体中，形成DNA前病毒；然后在RNA聚合酶的作用下，完成复制RNA病毒的核酸，并翻译成病毒的外壳、反转录酶，以出芽生殖的方式将组装成的病毒扩散到其他细胞中。此病毒攻击的主要是牛只的B淋巴细胞，然后经过各种途径之后造成其他细胞的感染，最终导致牛只的死亡[3]。

2 分子诊断

随着科学技术的不断进步和发展，分子生物学检测牛白血病的方法具有灵敏度高、准确性好的优势，且由于牛白血病病毒的基因可以整合到牛只细胞基因组中，其他方式几乎无法检测到牛白血病病毒基因组，故在检测牛白血病病毒时分子生物学检测逐渐取代了传统的血液学检测、血清学检测、酶联免疫吸附等方式，使从牛只的新鲜肿瘤或者外周血单核细胞样本中检测到牛白血病病毒的基因组成为可能。在诊断牛白血病病毒时常见的分子生物学技术包括聚合酶链式反应（PCR）、实时定量聚合酶链式反应（qPCR）技术、荧光共振能量转移聚合酶链式反应（FRET-qPCR）等。

2.1 PCR技术

此技术是最普通的PCR检测方式，也是最先被使用来进行牛白血病病毒检测的分子生物学技术，具有加速检测流程、敏感性、特异性强的优势。此技术主要是对牛白血病病毒的前病毒DNA进行检测。具体操作流程如下：采集或者使用在-80 ℃冰箱保存的牛只全血样本；根据NCBI网站查找已经报道过的关于牛白血病病毒的基因序列，并利用Primer 5.0设计特异性的引物（即引物设计）；用已知阳性牛只的血液样本和购买的DNA病毒提取试剂盒将样本中病毒的DNA提取出来，并根据提出的DNA作为模板进行PCR扩增，所使用的试验条件为在95 ℃下预变性5 min。进入循环：在95 ℃条件下变性45 s，56 ℃条件下退火35 s，72 ℃条件下延伸30 s，一共进行35个循环；之后在72 ℃条件下延伸10 min，结束之后观察电泳结果，发现在牛白血病病毒阳性的样品中扩增出了大小为194 bp的目的片段，故说明使用前病毒DNA样本的PCR技术能够准确检测出牛白血病病毒[4]。

2.2 实时定量PCR技术

此诊断技术能够弥补由于酶联免疫吸附或者其他检测方式由于牛白血病病毒相关抗体、抗原含量低而导致阴性的结果，检测阳性样本时仅需3个拷贝数。具体操作如下：首先要找到牛白血病病毒的基因序列，推荐使用的是Gen Bank数据库；然后进行筛选，从基因库中选出高度保守的区域，并选择出具有特异性的基因序列，通过使用FAM荧光、MGB标记的方式对上下游进行标记以此来设计探针引物；接着使用实时荧光PCR反应来确定标准曲线（即Ct值与浓度之间的线性关系）；最后根据标准曲线扩增出关于牛白血病病毒长度为79 bp的特异性片段[2]。

2.3 荧光共振能量转移PCR技术

此技术具有稳定性好、灵敏度高、不扩增其他牛常见病原体的优势，且可以检测牛只血液、阴道分泌物、牛奶、粪便中的牛白血病病毒，但是检出率最高的是检测血液中的病毒。具体操作如下：设计并合成FRET-qPCR引物和探针，通过利用GenBank数据库和利用Clustal multiple alignment algorithm软件分别找到牛白血病病毒的全基因序列和其中的保守区域以此来设计一对引物和探针；制备阳性对照，即是根据牛白血病病毒中的pol基因中的目的片段合成质粒并在大肠杆菌中表达；通过使用Hind Ⅲ限制性内切酶对质粒进行线性化；根据PicoGreen算法对已经线性化的质粒中的双链DNA进行定量和稀释并获得标准曲线以计算样品浓度；建立FRET-qPCR反应所需的条件；最后根据FRET-qPCR扩增曲线和高分辨率溶解曲线对得到的试验结果进行判断（Ct值＜30时且此时得到的Tm值在60～62 ℃之间则判定为阳性）。使用此方法得到的奶牛血液中的阳性率最高，为75.2%；陰道分泌物的阳性率次之，为49.5%；牛奶中的阳性率为46.7%；粪便中的阳性率最差为7.6%。且若血液中检测结果为阴性的牛只，同一头牛其他三个部位的样品检测结果也为阴性[5]。

3 基因治疗

目前尚未研发出治疗牛白血病的特效药，因此常用基因治疗的方式来治疗种用价值或者其他价值较高的牛只，对于一般牛只若患有白血病之后则采用淘汰的方式进行处理。基因治疗是将外源正常的基因导入到牛只靶细胞以达到纠正或者补偿缺陷基因、异常基因的目的，从而实现对牛只的治愈。在治疗牛只白血病时常用的基因治疗技术包括RNA干扰技术。

RNA干扰技术的原理是在牛只细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA从而使内源性的mRNA发生降解，最终达到使牛白血病基因沉默的目的。此技术具有特异性强（只引起特定基因的降解而不会引起其他基因的沉默）、效率高（在治疗过程中只需少量的同源的双链RNA即可有效抑制靶基因的表达，且进行方式是催化放大）、可进行传播（即可以在细胞群落之间进行传播，注射到某个部位之后进而传播到整个机体）、稳定性高（双链的RNA性质稳定，不需要进行修饰）、遗传性好（当在父母代中注射双链RNA后，其子一代中也存在同樣基因抑制的现象）等优势。

4 预防措施

对于牛白血病常见的预防措施包括定期检疫、定期驱虫、严格引种等。

4.1 定期检疫

由于此病的潜伏期较长，且对于患病的牛只尚无特效药进行救治，因此做好定期检疫是预防此病发生的重要措施之一。当牛只患白血病之后，其最典型的特征就是血液中的淋巴细胞数量增多明显，因此，可以通过定期对全群的牛只以全检或者抽检的方式来检测血象变化，当牛只血液中白细胞超过70%的增量且发生异常增生时即可确诊为白血病。而定期检疫的时间一般为2～3个月；对于检疫结果为阳性的妊娠母牛，其所产犊牛应该单独隔离饲养至6月龄以上。对于确诊的牛只要及时进行淘汰和扑杀，以此来慢慢实现对牛群的净化[6]。

4.2 定期驱虫

由于牛白血病可以通过吸血昆虫、蚊蝇等进行机械性的传播，因此牛群驱虫工作实施的好坏直接决定了牛群的发病率。对于寄生在牛只体表（螨虫、蜱虫等）或者体内（线虫、绦虫、吸虫）的寄生虫，可以通过定期药浴、饲喂驱虫药物（芬苯达唑伊维菌素片）的方式来驱虫，一般药浴选择在天气晴朗、温度适宜的夏秋进行；饲喂药物一般选择在早晨饲喂之前空腹灌服驱虫药以保证驱虫的效果。对于圈舍内蚊蝇，尤其是炎热多雨夏季更适合蚊蝇的滋生，此时需要每日打扫牛只排泄的粪便，并每周进行灭蝇，保证圈舍的清洁、干燥，破坏适合蚊蝇生存的环境。另外，也要及时处理圈舍周边的杂草等，避免蚊蝇滋生。

4.3 严格引种

养殖场尽量坚持自繁自养的基本原则，减少从其他地区引入牛只或者使用精液。确需引种时，则需要对新引入的牛只进行单独的隔离饲养，并在隔离期间多次进行牛白血病抗体的检测以及血液中淋巴细胞的检测，隔离期满后确认未携带牛白血病病毒后再与原群进行混养。

5 小结

由于牛白血病是我国乃至世界范围内危害比较严重的疾病之一，因此为了促进我国养牛业的健康持续发展，保证养殖户的经济效益，必须掌握牛白血病的分子诊断方式，发现有较高经济价值的牛只患病后及时采取有效的基因治疗方案，并通过定期检疫、定期驱虫以及严格引种等措施最大限度地降低此病的发生率。

参考文献：

[1] 彭雅兰.牛白血病病毒全长感染性克隆的构建和生物学特性研究[D].扬州大学，2022.

[2] 王丽红.牛白血病的诊断和防治方法及措施[J].中国畜禽种业，2021，17（12）：66-67.

[3] 王瑞林.牛地方性白血病的诊断和预防[J].中国动物保健，2023，25（4）：48-49.

[4] 宫洪杰.牛白血病病毒的鉴定及防控[J].畜牧兽医杂志，2022，41（4）：19-20.

[5] 杨奕.牛白血病病毒分子流行病学调查及其致病性的研究[D].扬州大学，2018.

[6] 红华.牛白血病的诊断与防治[J].兽医导刊，2021（1）：32.