猪流行性腹泻疫苗研究进展

吴钰宸 曹剑 孙彦军 刘强德 张常锁 贺笋

摘要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。临床上以呕吐、腹泻、脱水和高死亡率为特征，多发生于猪的初生、断奶、育肥等重要阶段。目前，世界各国都已将该病作为猪病的重点防控对象，我国也将其列为重大动物疫病之一，采取了严格的免疫程序以控制该病，疫苗是防控本病最重要的手段。本文就近年来猪流行性腹泻疫苗研究进展进行综述，以期为该病的防控提供参考。

关键词：猪；猪流行性腹泻；疫苗；研究进展

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种病毒性疾病[1]。PEDV主要感染猪肠道，引起猪的腹泻、呕吐、食欲不振等症状。PEDV可通过粪便、呼吸道分泌物等途径传播，病毒颗粒在环境中具有较强的稳定性，容易在猪场等集约化养殖场所传播。PEDV对幼猪的影响尤其严重，感染后的幼猪易出现腹泻、呕吐等症状，病死率较高[2]。

PEDV最初于1971年在英国被发现，后在欧、美、亚洲等地区均有分布。近年来，PEDV在中国大陆等地区暴发流行，给养猪业带来了严重的经济损失。目前，针对PEDV的疫苗已经开发出来，但是PEDV的变异性较大，疫苗的研发和应用仍面临一定的挑战。本文通过对猪流行性腹泻病毒的病毒学特征、流行病学特点以及疫苗研究最新的研究进展进行详细综述，以期能为该病的防控及疫苗研发等工作提供一个理论参考。

1 PEDV

PEDV是一种单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科，α-冠状病毒属。其病毒粒子形态呈圆形或多边形，直径范围为90～190 nm，平均直径130 nm。PEDV的病毒粒子由四个主要结构组成，分别是外膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）和纤突蛋白（S蛋白）。PEDV对于外界的抵抗力相对较弱，对氯仿乙醚等敏感，酸碱、甲醛、脂溶剂等消毒剂都可轻松将其杀灭。

2 流行病学

猪流行性腹泻主要通过口鼻分泌物、粪便等途径传播。最早于1971年在英国被发现，目前已在全球多个地区流行。其主要感染幼猪，成年猪一般不易感染，但对于未感染过的成年猪，也存在一定的感染风险。具有高度的传染性，病毒颗粒可以通过空气、食物、水、器具等多种途径传播，其中最主要的传播途径是直接接触感染和粪-口传播。PED发病率和死亡率很高，仔猪病毒感染后，出现急性腹泻、呕吐、发热等症状，严重者可导致死亡。对猪业造成了很大的经济损失，因为它不仅会导致猪只死亡，还会导致生长发育受阻、饲料利用率下降等问题，从而影响猪只的生产效益。

3 猪流行性腹泻病毒疫苗研究相关进展

3.1 传统疫苗

1）灭活疫苗。通过将病原体灭活后制成的，因此不会引起疾病，但可以刺激猪体内的免疫系统产生抗体，从而在接触到真正的病原体时提供保护作用。该疫苗通常在猪的幼年时期接种，可以有效地预防猪流行性腹泻的发生。2016年，利用PEDV韩国流行毒株KNU-141112生产制造的灭活疫苗，通过妊娠母猪产前6周、3周进行肌肉注射免疫后，利用强毒毒株进行激发后，仔猪的存活率达到92%，仔猪腹泻减少[3]。郑培等[4]研究表明，采取在母猪产前30和15d进行免疫后，母猪的血清及初乳中可以产生高水平且稳定的IgG、IgA特异性抗体以及中和抗体，对于仔猪的保护效果显著。

2）减毒活疫苗。该疫苗是通过将猪流行性腹泻病毒进行减毒处理，制成的一种活疫苗。通过将猪流行性腹泻病毒进行体外培养和多次传代，减弱其病原性，使其仍然能够在宿主体内产生免疫效应，但不会引起严重的疾病反应。减毒活疫苗接种后，病毒能够在猪体内复制，引起一定的免疫反应，从而使猪体内产生针对病毒的特异性免疫反应，形成免疫保护，预防猪流行性腹泻的发生和传播。其具有高效保护、安全性高、经济性强、方便易用等优势。Deng等[5]通过诱导干扰素早期I型和Ⅲ型的转录激活过程，将PEDV EndoU中226点位上的组氨酸（H）突变为丙氨酸（A），其病毒的毒力明显削弱。

3.2 亚单位疫苗

亚单位疫苗与传统的灭活疫苗和减毒活疫苗比较，其最大的优点就是安全性较高，抗原成分清晰、没有引起机体不良反应的其他抗原，其还有生产成本低廉、产量高等优点。但是缺点也同样明显，疫苗抗体水平较低、免疫原性较弱，保护期较短[6]。亚单位疫苗免疫原性水平较低的问题可通过与佐剂或者免疫增强剂联合使用提高免疫原性水平[7]。

Hou等[8]利用乳酸杆菌表达PEDV-N蛋白，结果表明，能够刺激仔猪肠道黏膜产生高水平的黏膜IgA和循环IgG对PEDV抗原N的免疫反应。Zhao等[9]利用不同表达系统表达了部分PEDV S蛋白，通过口服、肌肉注射等不同免疫方式给小鼠或猪进行免疫，均能表达出高水平的抗体。郭涛[10]构建重组表达菌株，通过包涵体形式表达出大小约为35 kDa的重组PEDV COE蛋白，通过口服的方式免疫仔猪后，在粪便和唾液中只能检测到低水平的特异性sIgA抗体，但是通过肌肉注射的方式进行免疫，能够刺激仔猪血清中的IgG明显升高。

3.3 核酸疫苗

目前各种疫苗都有其优缺点，灭活疫苗的研发周期相对较短，但疫苗的免疫原性较差。减毒活疫苗的免疫原性良好，但研发周期较长。然而，PEDV的基因组一直在发生着变异，此时就需要一种安全性高、成本低、研发周期短以及设计简单的疫苗。核酸疫苗应运而生，其中包括DNA疫苗和mRNA疫苗。根据Naik[11]书中所写，疫苗研制平臺一旦建立，其相互通用，只需要将有效的中和抗原基因序列合成并插入到适当的表达载体中，就有可能在短时间内开发出针对新暴发、大规模流行性传染病的疫苗。Yin等[12]构建了共表达PoRV VP7蛋白和PEDV S蛋白的DNA疫苗，小鼠经过免疫后，出现高水平的免疫应答。目前，核酸疫苗在新冠疫情的过程中大规模应用，其抗体产生快、保护率高、对变异毒株也能有效保护等优势已经显现，相信随着技术的不断发展，mRNA技术的进步，核酸疫苗在兽用疫苗领域的应用指日可待。

3.4 轉基因植物疫苗

转基因植物疫苗是利用转基因技术将特定病原体的抗原基因导入植物细胞中，使植物细胞能够表达出相应的抗原蛋白，从而制造出具有免疫作用的疫苗。相比传统疫苗制造方法，转基因植物疫苗具有生产成本低、易于大规模生产、保存和运输等优势。其不仅可以单独使用引起机体的免疫反应，也可以与常规疫苗联用，达到加强免疫的效果[13]。Tien等[14]利用PEDV核心中和表位（COE）制作一种的PEDV候选疫苗，将COE连接到聚合免疫球蛋白G支架（PIG）上，并在烟草植物中得到表达。小鼠免疫试验证明可诱导全身和黏膜抗原特异性免疫反应。Egelkrout等[15]表达了含有PEDV S1纤突蛋白的玉米，并与载体蛋白大肠杆菌热不稳定亚基（LTB）和树突状细胞（DC）结合肽融合，抗原水平高于20 mg/kg。猪口服给药可诱导血清中和抗体，可用于饲料中。

4 总结与展望

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，人们对PEDV的认识不断深入，也使PEDV疫苗的研发取得了很大的进展。随着基因工程技术的不断发展，将会有更多新型疫苗在动物上进行试验研究。但是由于PEDV在世界范围内流行时间较长，已有的疫苗在不同地区或国家的适应性、保护效果和安全性等方面存在差异，所以对于PEDV的研究仍然具有很大的挑战性。另外，病毒感染后机体免疫应答系统变化很大，因此单一蛋白或者单一基因工程亚单位疫苗无法解决所有问题。在今后的研究中，将会结合基因工程、蛋白质工程和纳米生物技术等手段对病毒蛋白或基因进行改造和优化，进一步提高疫苗免疫效果和安全性。另外，灭活疫苗虽然有较好的安全性、有效性和免疫原性，但是它仍然存在一些缺陷和不足之处。因此，研究开发新型疫苗将成为今后PEDV研究的热点。目前，PEDV灭活疫苗仍存在以下问题：①由于目前的灭活苗没有针对病毒变异株的新型佐剂，所以保护效果较差；②灭活苗制备过程中，会有较多的毒素和杂质进入疫苗中，导致疫苗质量不稳定；③灭活苗不能诱导动物产生保护性抗体，这是因为灭活苗的抗原含量太少，无法刺激动物产生足够的抗体；④灭活苗只能提供细胞免疫应答，而细胞免疫应答往往不足以抵抗病毒感染。

此外，PEDV疫苗研制应考虑以下问题：①猪只接种疫苗后产生抗体需要一定时间，所以应根据猪只不同生长阶段制定合理的免疫程序；②接种疫苗后产生抗体是机体产生免疫保护的基础，因此需要加强对抗体水平的监测和对抗体消长规律的研究；③PEDV病毒株变异较快，所以疫苗需要定期更换；④现有疫苗都是灭活疫苗，所以需要开发和研究新型的佐剂及佐剂载体以提高疫苗免疫效果；⑤灭活苗需要在低温环境下保存和运输，而疫苗稳定性对于动物来说非常重要，因此需要对疫苗保存条件进行研究。

总之，随着分子生物学技术和分子生物学理论在PEDV研究中的不断深入应用，PEDV研究也必将会取得更多更好的进展。相信在不久的将来，在大家共同努力下PEDV一定会被有效控制。但由于PEDV的复杂性和多样性以及人们对其认识上的局限性，还需要更多高质量、安全有效、低成本和易推广应用的PEDV疫苗。

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