莱阳地区鸡场沙门菌分离鉴定与耐药性分析

万惠愚

摘要：为了分析莱阳地区鸡场中沙门菌的流行情况和耐药性情况，2022-2023年采集莱阳地区中56个鸡场中疑似沙门菌感染的鸡的肛拭子、粪便、肝脏、脾脏及肾脏病料组织样品213份，采用细菌分离培养、革兰氏染色、生化试验鉴定及PCR扩增鉴定等多种方法进行沙门菌分离鉴定。采用人工感染试验动物和K-B药敏纸片法对分别检测分离的沙门菌的致病性及对常用药物的耐药性。结果表明，从莱阳地区中56个鸡场中疑似沙门菌感染的鸡的肛拭子、粪便、肝脏、脾脏及肾脏病料组织样品213份中分离得到119株沙门菌，其中82株菌可以引起雏鸡的发病与死亡，对雏鸡的死亡率在40%之间；82株致病性沙门菌对磺胺间甲氧嘧啶、多西环素、新霉素等8种药物耐药率在58.5%～100.0%之间，对其他药物存在不同程度耐药性。结果表明，从莱阳地区鸡场中得到92株致病性沙门菌对常用的抗菌药产生不同的耐药性。本研究为莱阳地区鸡场中沙门菌的流行病调查及指导临床合理用药提供参考依据。

关键词：鸡；沙门菌；分离鉴定；致病性；耐药性

随着我国畜牧業的发展，我国的蛋鸡和肉鸡的养殖数量呈现逐年升高的趋势，蛋鸡和肉鸡的养殖模式已经形成规模化、集约化的养殖模式，我国成为蛋鸡和肉鸡生产与消费大国，在蛋鸡和肉鸡的养殖过程中，沙门菌成为危害我国蛋鸡和肉鸡的主要细菌性疾病之一[1]。国内外许多相关研究表明，不同血清型的沙门菌在世界各个国家不同地区的鸡场中广泛流行，尤其是不同血清型的沙门菌在不同地区中蛋鸡和肉鸡的种鸡场中流行，主要由于该菌可以通过水平传播和垂直传播，目前没有有效的沙门菌疫苗对种鸡场进行免疫，也是导致不同血清型沙门菌在不同地区蛋鸡和肉鸡的种鸡场中流行的主要因素之一[2]。沙门菌不仅可以引起猪、鸡、鸭、鹅、牛、羊等多种动物发病，同时也是临床中常见的食源性病原菌之一，该菌可以作为主要的食源性病原菌引起人的感染，人通过食源性感染沙门菌，该菌感染人后临床中主要以肠炎、腹泻为主，严重者可以导致其死亡，因此，沙门菌成为临床中重要的人畜共患的病原菌[3-4]。相关研究表明，鸡、鸭、鹅等家禽是沙门菌主要的携带宿主之一，该菌在不同地区不同鸡场中广泛流行，尤其是对蛋鸡和肉鸡的种鸡场中沙门菌的净化与防控具有重要的意义[5]。在蛋鸡和肉鸡的养殖过程中由于没有有效的疫苗，主要通过抗菌药物进行治疗，由于抗菌药物的不合理使用，大部分从蛋鸡和肉鸡场中分离得到的沙门菌对常用的抗菌药物产生很强的耐药性，且出现对临床中常用的药物出现多重耐药性[6]。因此，对蛋鸡和肉鸡场中沙门菌的监测具有重要的意义。本研究以莱阳地区中56个鸡场中疑似沙门菌感染的鸡的肛拭子、粪便、肝脏、脾脏及肾脏病料组织样品213份中分离的沙门菌为研究对象，对其致病性、抗菌药物的耐药情况检测，为减少耐药性传播和指导临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源

2022—2023年采集莱阳地区中56个鸡场中疑似沙门菌感染的鸡的肛拭子、粪便、肝脏、脾脏及肾脏病料组织样品213份。

1.2 细菌分离培养

将采集的病料组织样品经过处理后，无菌的条件下接种于沙门菌显色培养基中进行沙门菌鉴别培养，37 ℃恒温培养箱培养12～18 h后，挑取优势的单个菌落按照说明书进行革兰氏染色，在显微镜下观察其分离菌株的形态学。

1.3 细菌生化鉴定

无菌的条件下，将沙门菌显色培养基上典型菌落接种于普通营养肉汤中，37 ℃恒温振荡培养8～12 h，按照梅里埃革兰阴性菌鉴定试纸条说明书，将纯化培养的菌株在无菌的条件下接种到梅里埃革兰阴性菌鉴定试纸条中，37 ℃培养12～18 h后，进行比对确定其生化特性。

1.4 细菌的PCR鉴定

参考文献[7]报道的，采用水煮法提取分离菌株的基因组DNA，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成细菌通用引物16SrRNA基因序列，F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTTG-3'；目的条带为1 500 b。采用细菌通用引物以提取的分离菌株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定。将分离菌株检测为阳性的PCR产物回收送华大基因公司测序与比对。

1.5 致病性试验

将分离的沙门菌在无菌的条件下普通营养肉汤中培养至对数期，用无菌的营养肉汤调整分离菌株的菌液浓度为108 cfu/mL，攻毒组每1株分离菌株通过腹腔注射攻毒5只1日龄雏鸡，每1只雏鸡的攻毒剂量为0.2 mL，对照组的雏鸡给予等量的无菌PBS。在致病性试验期间（7 d）观察雏鸡的发病死亡情况。

1.6 药敏试验

无菌的条件下将沙门菌显色培养基长出的典型菌落接种于普通营养肉汤中培养至对数期，调整分离菌株菌液浓度为108 cfu/mL，参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐的标准药敏试验法进行操作和试验结果判断[8]。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定

疑似沙门菌分离菌株在沙门菌显色培养基上长出浅绿色的大小一致的菌落，对纯化的菌株经革兰氏染色显微镜观察其形态学可见单个或者聚在一起的两头钝圆的革兰氏阴性的杆菌（图1）。与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的沙门菌的培养特性及形态学基本上一致。

2.2 细菌生化试验鉴定

通过梅里埃革兰阴性菌鉴定试纸条对分离菌株进行生化鉴定，结果显示，119株临床分离菌株的生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的沙门菌的生化特性基本上一致。分离的119株临床分离株初步鉴定为沙门菌。

2.3 细菌的PCR鉴定结果

对临床中分离的菌株用细菌通用引物16S rRNA进行PCR鉴定。PCR鉴定结果显示，119株沙门菌分离菌株均扩增出大约为1 500 bp的目条带（部分菌株见图2）。通过测序临床中分离的119株菌株的基因序列与GenBank中登录沙门菌的同源性高达98%以上，其临床分离菌株鉴定为沙门菌。

2.4 致病性试验

攻毒组的雏鸡在攻毒后2～6 d出现不同的发病与死亡情况，个别的雏鸡未表现任何临床症状出现死亡。从死亡的雏鸡体内分离得到沙门菌，在整个攻毒试验期间对照组的雏鸡健康的存活。不同的分离菌株对雏鸡的致死率在40%～100%之间，经过统计82株为致病性沙门菌。

2.5 耐药性分析结果

结果由表1可知，临床中分离的82株致病性沙门菌对磺胺间甲氧嘧啶、多西环素、新霉素等8种药物耐药性较强，耐药率在58.5%～100.0%之间；对头孢噻呋、头孢噻肟、氟苯尼考等8种药物的耐药率在3.7%～30.5%之间。

3 讨论

鸡沙门菌病是由不同血清型致病性沙门菌引起的一种鸡的细菌性传染病，该菌主要分为鸡白痢、禽伤寒及副伤寒等，该菌可以感染不同阶段的鸡，其中以雏鸡最易感，临床中以败血症、肠炎、腹泻为多见，该菌对雏鸡的感染率和死亡率均较高，给养鸡业造成严重经济损失[8-9]。近几年，国内关于鸡场中沙门菌的流行报道的越来越多。本试验研究表明，从采集的56个鸡场中213份样品中分离得到82株致病性沙门菌，说明该地鸡场中沙门菌在广泛流行，应该注意鸡场中沙门菌的净化与综合防控。国内相关研究表明，鸡场中流行的沙门菌的耐药性也逐年增加，存在多重耐药现象，给该菌的防治带来一定困难[10]。本试验研究表明，临床中分离的82株致病性沙门菌对常用的抗菌药物产生严重的耐药性。许多相关研究表明鸡场中流行的沙门菌的耐药性很普遍，在临床中应该引起重视，合理使用抗菌药物，减少耐药性的产生。

参考文献：

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