鸡肾型传染性支气管炎病毒分离与鉴定

于逢强 王春华

摘要：山东龙口地区某鸡场相继发生以白色水样痢疾、迅速消瘦、采水量增加为主要临床特征的疾病，通过采集病料接种鸡胚传代培养后分离到一株毒株，对该毒株进行血凝试验、NDV干扰试验、琼脂凝胶扩散试验及雏鸡回归试验研究。结果表明，经过持续的鸡胚传代，第3代开始形成蜷缩胚，第5代蜷缩的胚胎达到50%；第3代到第5代的尿囊液经过1%胰蛋白酶进行处理后具备了血凝性；该分离株在干扰实验中很大程度影响了NDV在鸡胚中的增殖；在雏鸡回归试验中，试验雏鸡感染了分离的病毒后，致死率为60%，发病率可以达到100%；感染鸡出现斑驳肾等病理变化，实验结果充分表明分离到的病毒为鸡肾型IBV。

关键词：鸡；肾型IBV毒株；分离鉴定

鸡肾型传染性支气管炎（infectious bronchitis，NIB）是由嗜肾型传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的鸡的一种急性、高致死性、接触传染的呼吸道传染病[1]，该病血清型多，主要分为呼吸型、肾型、肠型、肌型，以鸡肾型IBV最为常见[2]。所有年龄的鸡均易感IBV，6周龄以下雏鸡中更为明显，主要感染途径是空气传播。该病发病急，潜伏期较短，约为1～2d，病鸡主要表现为反复咳嗽、频繁打喷嚏，大量流鼻液，鸡肾型IBV疾病的鸡由于肾脏肿胀，还会产生尿酸浓度高的沉淀症状[3-4]。鸡肾型IBV毒力的强弱、免疫抗体效价高低、鸡舍内的日常饲养及管理方法等因素影响该病鸡同时表现了不同严重程度上的多种临诊和症状，有表现的程度比较的严重，有出现的则比较轻微[5-6]。IBV频繁发生对养鸡业造成了极大的损害，它已成为我国和世界其他地区养鸡业中最严重的家禽传染病之一，通过分离鉴定IBV不仅是确诊该病的有效方法，也为该毒株在该地区的流行病学调查提供数据监测[7]。

本文通过研究山东省龙口地区某养鸡场病鸡的死亡原因，从病死鸡的肾脏、肝脏和其他组织中获得并鉴定病毒株，经病毒分离、血凝试验、干扰试验、琼脂凝胶扩散试验和回归试验，最终分离出的病毒为鸡肾型IBV，为该地区鸡肾型IBV的发现和防治提供依据和参考，对养鸡业的健康发展具有重要意义。

1 材料

1）主要试剂。灭菌生理盐水、双抗（青霉素、链霉素）、卡那霉素均购自外圣中医药科技（烟台）有限公司，胰蛋白酶溶液（1%）、NDV弱毒苗、IBV标准抗原及标准阳性血清购自上海远慕生物科技有限公司。

2） 仪器与设备。恒温生化培养箱（LHS-100CB一恒仪器）、台式离心机（LXJ-4）、冰箱（BCD-329WDVL海尔）、组织捣碎机（德国Qiagen公司）、超净工作台（USA Forma Scientific）、照蛋器。

3） 试验动物。9～11日龄的SPF鸡胚，3周龄的SPF雏鸡均购于山东某实验动物繁育有限公司。

4）病料采集。无菌采集具有典型症状的病鸡肾、肺、喉头气管、肝等组织，放入双抗和卡那霉素的PBS溶液的10 mL EP管中，-20 ℃冰箱保存备用。

2 方法

1） 病料处理。将病料放组织捣碎机研磨，制成1∶5的混悬液，-20 ℃与37 ℃间反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存备用。

2） 鸡胚接种与传代。取病料处理液，接种至9～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔中，每胚接种0.2 mL，共接种10胚，同时另设接种生理盐水对照组2胚，同步放置37 ℃恒温培养箱中孵育。每隔6～8 h照蛋一次，丢弃24 h内的死胚，并按实验室生物安全规定处理；收集72 h后的死胚和部分活胚的尿囊液再接种至9日龄SPF鸡胚的尿囊腔中，其余活胚继续孵育至17日龄后放入4 ℃冰箱中完全冷冻，仔细观察并记录鸡胚病理生理变化，盲传五代。

3） 血凝试验。将收集的尿囊液分别以3 000 r/min的相同速度离心10 min，去除后用注射器注入乳清液中。第一次，提前加入1%的血清胰蛋白酶。第二次是在经过高温灭菌或同样灭菌处理的无菌盐水溶液中。该株在37 ℃水浴中煮沸约2 h后，用微量法测定全血清RBC凝集值。样本中存在所有细胞凝集的病毒血清的最高溶液稀释度用于计算含有病毒样本的血清中RBC细胞的总凝集量。

4）干扰试验。将10日龄的SPF鸡胚分成四组，每组5个胚。第一组经尿囊腔接种E5代病毒液0.2 mL/个；第二组接种NDV弱毒株疫苗0.2 mL/个；第三组在第1组基础上，10 h后接种NDV弱毒株疫苗0.2 mL/个；第四组接种0.2 mL/个无菌生理盐水作为实验对照组。同步放置37 ℃孵育72 h，无菌收取尿囊液，并測定各组NDV的HA滴度。

5） 琼脂凝胶扩散试验。采用常规7孔方法，外环标记1-6编号，中间孔加标准IBV抗原，编号1加健康鸡血清，编号3、5、6加入病鸡血清，编号2、4加入标准阳性血清至满，放37 ℃的恒温箱中48 h，观察并记录每天的情况变化。

6）雏鸡回归试验。将20只3周龄SPF雏鸡分为两组。第一组为实验组，第二组为对照组。第一组先通过眼睛、鼻腔和口腔接种第5代SPF鸡胚尿囊液，第二组接种等量的灭菌生理盐水。观察并记录鸡的临床反应和症状，对死亡鸡剖检，观察病理变化并记录。

3 结果与分析

1）鸡胚接种情况。将病料处理后接种鸡胚盲传5代，连续观察鸡胚的发育情况，结果发现，第1代（E1）无明显病变，第3代（E3）开始形成蜷缩胚，第5代（E5）蜷缩的胚胎达到50%，且鸡胚死亡数增加，病变明显。

2） 血凝试验结果。分离毒株尿囊液的血凝价为0，但使用1%胰蛋白酶处理之后，分离毒株的血凝价为6 log2，对照组鸡胚的尿囊液血凝价为2 log2。试验结果表明，分离到的病毒自身并没有血凝性，然而使用1%的胰蛋白酶处理后，该病毒则具备了血凝性。

3）干扰NDV试验情况。经试验，结果如表2显示，第一组只接种病毒液及第四组只接种无菌生理盐水作为实验对照组的血凝价均为20；第二组只接种NDV弱毒株疫苗血凝价为28～29；第三组接种病毒液及NDV弱毒株疫苗，血凝价为23～24。试验结果表明，分离到的疑似鸡肾型IBV的病毒很大程度上影响到了NDV在鸡胚中的增殖，具有明显的抑制作用，该现象为IBV特有。

4） 琼脂凝胶扩散试验结果。标准阳性血清与标准抗原之间形成沉淀线，与阳性对照沉淀线连接良好，试验结果呈阳性。

5） 雏鸡回归试验结果与分析。攻毒试验3 d后，对照组均未见异常，试验组雏鸡开始出现临床呼吸道症状，包括频繁咳嗽、打喷嚏和啰音。无精打采，饮水增加，精力不足，经常拉白或水样便，消瘦，羽毛蓬松等。尸体解剖后，病死鸡肾脏肿胀大出血，呈“斑点肾”样，肾小管和输尿管内有大量尿酸盐沉淀，并有不同程度的扩张。以上糖尿病的临床特征和病理改变均以死鸡肾型IBV感染为特征。

4 讨论

近年来，鸡肾型传染性气管炎病毒已成为家禽重要致病源之一。全球对该病毒的动态监测研究也持续开展[8]，自1936年该病原被发现以来，在世界各地已分离上百毒株IBV，共有30多种血清型，并不断有新的血清型被发现，其血清型众多、临床症状复杂，交叉保护性低，变异株不断出现等问题，是IB防制工作的难点[9]。本文根据临床症状分离获得地区性流行的IBV，并对流行毒株进行病理性、免疫性研究，为IB临床治疗措施提供更丰富的理论依据，也可为研制IB疫苗或抗病毒药物提供新的思路。

本研究在鸡群发病，根据临床初步诊断，疑似鸡传染性支气管炎后，采集病料经鸡胚接种盲传、血凝试验、NDV干扰试验、琼脂凝胶扩散试验及雏鸡回归试验研究确认分离获得一株肾型传染性支气管炎病毒。该毒株鸡胚传至E3代出现胚体发育受阻，出现蜷缩胚的现象，传至E5代蜷缩的胚胎达到50%。用E5代病毒液感染SPF鸡可表现与自然发病鸡相似的临床症状，同时病理变化呈现肾脏肿胀大出血，呈“斑点肾”样，肾小管和输尿管内有大量尿酸盐沉淀，具有典型的肾型IBV特征，但该毒株的更多血清型和免疫原性有待进行进一步的深入研究。

由于IBV的多型性和可变异性，给本病的有效防治带来了不少困难。目前尚未有该病的特效疗法的报道[10]，因此重视早期防控干预，关注地区的流行情况，通过加强对鸡群的饲养管理，严格卫生消毒，完善生物安全体系是预防雏鸡肾型传染性支气管炎的关键；同时做好鸡传染性支气管炎疫苗免疫，对鸡肾型IBV高发地区，可提前1日龄免疫，使雏鸡尽早产生抗体，并适宜增加免疫次数，增强雏鸡抗体保护；对发病鸡群及时隔离治疗，必要时进行淘汰，避免更大的经济损失。

参考文献：

[1] 李玲娟.菏泽市肉鸡肾型传染性支气管炎的流行病学调查[J].山东畜牧兽医，2016，37（9）：62-63.

[2] 杨奉弛.鸡肾型传染性支气管炎危害及防治措施[J].中国畜禽种业，2021，17（1）：189-190.

[3] 王兆芬.鸡肾型传染性支气管炎的危害及综合防治[J].中国动物保健，2022，

24（5）：61-62.

[4] 姜长城.鸡肾型传染性支气管炎的临床症状及治疗[J].农业开发与装备，

2019（2）：239.

[5] 于柳.一例雛鸡肾型传染性支气管炎的防治[J].畜牧兽医科技信息，2017（4）：94.

[6] 石浩.鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定[J].养殖技术顾问，2013（2）：70.

[7] 李浩然，李哲，孟凡生，等.山东地区鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定及防治[J].家禽科学，2018（9）：8-12.

[8] 李宁，郭连营，许普之，等.肾型传染性支气管炎病毒致病机理及疫苗研究进展[J].动物医学进展，2022，43（4）：82-86.

[9] 夏道伦，黄晓苹.雏鸡肾型传染性支气管炎的科学防控[J].农村新技术，

2022（6）：36-38.

[10] 于柳.一例雏鸡肾型传染性支气管炎的防治[J].畜牧兽医科技信息，2017（4）：94.