湖北襄阳地区水稻落粒、杆枯等不正常生长现象的解析

杨小林，薛敏峰，张舒，李进波，吕亮，常向前，张佑宏，龚艳

（1湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064；2华中作物有害生物综合治理农业农村部重点实验室，武汉 430064；3湖北洪山实验室，武汉 430070；4湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉 430064；5湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

0 引言

湖北省地处长江中下游，水稻一直是该省种植面积最大、总产最多的农作物，播种面积占全省粮食总播种面积的50%以上，总产占70%左右，商品量占80%。湖北水稻在种植面积、总产、单产、优质稻种植面积等方面多年来一直稳居全国各省市水稻生产的前列（2020年排第5）。襄阳地区是湖北省重要的水稻生产区，襄阳市南漳县武安镇、城关镇等地自2018年开始，已连续多年发生水稻收获前出现不明原因的不正常生长现象：水稻植株茎秆变褐色，穗褐变，谷粒黄皮红褐芯或黑皮红芯；发生区域、面积逐年扩大，因所收稻谷加工后米粒杂色，粮食收购部门拒收，农户直接和间接损失逐年加重。对于此异常生产现象，襄阳地区的水稻生产未有相似报道。真菌性病害水稻穗腐病(rice spikelet rot disease，RSRD)，病害初期时，颖壳上出现黄褐色病斑，后期病斑扩展至整个谷粒，谷粒变成黑褐色或黑色，穗部表面覆盖白色或黑色霉层，米粒畸形或变色，结实率下降，瘪粒多，严重影响水稻的产量和质量。目前全国多地对此病害均有报道，对引起病害的病原真菌进行了广泛的研究[1-2]。近年在湖北鄂东南稻区出现灾害[3]，发生区域、面积逐年扩大，损失也逐年加重。包括襄阳在内的鄂北麦茬稻区未曾报道出现穗腐病害。襄阳地区农户把连续多年自留的稻种用于生产后水稻出现杆枯、穗腐等不良生长现象，而用种正确的田块水稻生长正常，有必要探明穗腐病害和用种不科学对襄阳地区水稻生产的影响。2021 年9 月，湖北省农业科学院联合襄阳市农业科学院、襄阳市农业技术推广中心，对此生长异常现象展开实地走访调研，对其受害原因进行科学分析和探讨，以期为保障水稻安全生长提供科学指导依据。

1 材料与方法

1.1 异常生产情况调查与样品采集

2021 年9 月，在湖北省襄阳地区麦茬稻区就水稻生长异常情况进行实地调查和走访，在水稻黄熟期分田块采集水稻枯杆和腐穗病样多份并分袋保存，于田块中实地收集落粒稻谷，并将农户提供的自留6 年的‘黄华占’水稻种子，一并带回实验室进行检测。

1.2 供试化学药剂

用于毒力测定的化学药剂自购于市场。70%唑醚·丙森锌水分散粒剂(WG)，江西众和化工有限公司生产；23%醚菌·氟环唑悬浮剂(SC)，巴斯夫植物保护（江苏）有限公司生产。

1.3 自留水稻种子指纹检测

为分析农户多年自留稻种对水稻生长的影响，对不同来源的‘黄华占’稻种进行编号检测：编号1 为农户自留第6年的‘黄华占’稻种混合样，编号2为自留种中品相好的稻种，编号3 为自留种除去编号2 外的稻种，编号4为从田间小心收获的‘黄华占’稻谷（即农户自留6年种植的），编号5为新鲜的‘黄华占’稻种，购于正规市场，用于数据对照分析。采用CTAB法[4]提取水稻基因组DNA。41 对水稻特异性SSR 标记检测由武汉基诺赛克科技有限公司完成。

1.4 病原菌的分离、纯化、形态特征观察及柯赫氏法则验证

参照方中达[5]方法进行病原菌的分离、纯化和形态特征观察。于2022年4月中旬按常规方法进行盆栽水稻种植，每盆种植3 株为1 个重复，每菌株接种3 盆即为3次重复处理。参考前人方法于水稻扬花期进行针刺接种[6-7]，分生孢子液制备参照Li 等[8]方法。接种后14 d后观察分布情况，分别取样和分离鉴定，完成病原菌的致病性测定。以接种无菌水的‘黄华占’盆栽水稻作为对照处理(CK)。盆栽水稻置于室外，盆中保持浅水栽培，适时晒土。接种前移入玻璃温室中，温度控制于26℃。

1.5 分离菌分子生物学鉴定

参照黄世文等[1]的方法进行分离真菌的ITS 鉴定。通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)合成交由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，PCR扩增产物的测序交由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。在NCBI上通过BLAST对测序结果进行分析。

1.6 毒力测定

采用菌丝生长速率法[9]测定供试药剂对分离真菌的毒力。将供试药剂分别配成一定浓度的稀释液，加入常规PDA 培养基中，制作70%唑醚·丙森锌WG 浓度递度为0.7、7、21、35、70、140 μg/mL 的含药平板，制作23%醚菌·氟环唑SC 浓度递度为0.12、0.23、0.69、1.15、2.3、4.6 μg/mL的含药平板。将各分离菌培养7 d后，沿菌落外沿切取直径为5 mm的菌饼，置于含药平板中央，26℃恒温培养，各处理重复3 次，以不含药剂平板作为空白对照，7 d后测量各处理的菌落直径。

1.7 数据处理与分析

利用SPSS 22.0 版软件对药剂的毒力测定数据进行Probit 回归分析，计算药剂对各分离真菌的抑制中浓度EC50等，并进行卡方检验。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离和鉴定

湖北省襄阳市南漳县多个乡镇水稻收获前出现落粒、杆腐、穗腐、大量秕谷等不正常生产现象（图1）。从病发区采集样本，于实验室分离病样，分离菌经菌落培养、显微镜检及分子生物学鉴定，主要获得4种不同的菌株，分别记为XN01、XN02、XN03、XN05（图2）。

图1 田间采样及标本

图2 病原菌培养形态

XN01 菌在PDA 培养基上生长初期菌丝灰白色，后期变为灰黑色，气生菌丝发达，表面未隆起，边缘整齐，菌落反面中央深黑色，边缘灰白色。菌丝短粗有隔，孢子梗短，分生孢子黑色圆形或近圆形，孢子大小约13.59 μm×14.97 μm。XN02 菌在PDA 培养基上初期菌丝白色，后期淡橘色，气生菌丝发达，边缘棕色，较齐整，菌落反面淡橘红色。菌丝细长，内部分隔稀疏，孢子细长略弯，有2～4个分隔膜，孢子大小约5.29 μm×12.10 μm。XN03 菌生长菌丝淡粉红色，气生菌丝发达，边缘齐整，菌落反面黄白色。菌丝细长，孢子呈镰弯形，分隔膜多个，孢子大小约6.70 μm×30.33 μm。XN05 菌菌落粉色，气生菌丝发达，菌落表面绒状，边缘较齐整，菌落反面紫红色。孢子呈纺锤形，隔膜多为3个，孢子大小约4.24 μm×13.67 μm。

利用PCR技术对XN01、XN02、XN03、XN05菌进行ITS序列扩增（图3），4段序列的大小介于547～584 bp，通过BLAST比对分析供试菌株的ITS序列和已登录的模式菌株的序列，结果表明4个菌株的ITS序列分别与登录号为MH087476.1、MK814399.1、MH087476.1、MK079899.1的ITS序列相似性均达100%。结合形态特征，XN01 被鉴定为子囊菌门Ascomycota 粪壳菌纲Sordariomycetes 炭角菌目Xylariales 梨孢假壳科Apiosporaceae 黑孢属Nigrospora的稻黑孢Nigrospora oryzae；XN02、XN03 和XN05 依次被鉴定为子囊菌亚门Ascomycota 粪壳菌纲Sordariomycetes 肉座菌目Hypocreales 丛赤壳科Nectriaceae 镰孢属Fusarium的层出镰孢F.proliferatum、木贼镰孢F.equiseti和禾谷镰孢F.graminearum。

图3 分离病菌的ITS序列PCR产物

于水稻扬花期进行人工接种，接种后14 d后调查发病情况。健康水稻在接种4种菌液后叶鞘处茎杆均大面积开始变深褐色坏死状（图4）。接种XN01（稻黑孢菌），穗部出现浅褐色至深褐色谷粒，从谷粒尖端开始至整个谷粒，湿度大时病谷粒外包裹白色菌丝。接种菌XN02（层出镰刀菌），穗部谷粒多数变紫褐色，穗尖谷粒着色更深。接种菌XN03（木贼镰刀菌），穗部谷粒出红褐色，湿度大时整个穗部被白色菌丝包裹。接种菌XN05（禾谷镰孢菌），穗部谷粒上100%出现红褐色病斑，外面包裹白色菌丝。回收病样作病菌分离、纯化，分离菌株的培养性状与原接种菌株一致。

图4 接种XN01～XN05后稻穗和稻杆

2.2 自留水稻种的指纹检测

经41 对水稻特异性SSR 指纹（标记）检测（如图5所示），发现调研时从田间收获的‘黄华占’稻种有12个指纹不同于其他分类，即农户自留6 年的‘黄华占’稻种，种于田间当年收获所得的稻谷其检测指纹与‘黄华占’原种有差异，可能已经发生变异或非原种。

图5 水稻特异性指纹检测（部分）

2.3 防治药剂的毒力测定

本研究获得4种致病菌，分别是稻黑孢菌、层出镰孢菌、木贼镰孢菌和禾谷镰孢菌，为明确药剂对病原菌生长的抑制作用，开展相关药剂的毒力测定，结果表明，70%唑醚·丙森锌WG 对菌XN01～XN05 的EC50分别是15.2190、8.2373、7.6310、10.6223 μg/mL，23%醚菌·氟环唑SC对菌XN01～XN05的EC50分别是0.5657、0.2873、0.5623、0.9580 μg/mL，表明70%唑醚·丙森锌和23%醚菌·氟环唑对4 种菌株菌丝生长均有良好的抑制作用（表1）。

表1 药剂对XN01～XN05的毒力测定

3 结论与讨论

本研究实地走访和取样，采取常规分析方法和分子生物学技术，从植物病理和种子变异角度，通过菌株分离和鉴定、谷种鉴定等研究，对湖北省襄阳市南漳县内水稻出现大面积的不正常生长现象的原因进行了综合解析。襄阳市南漳县地处湖北省西北方，一直保留稻-麦轮作方式，前茬小麦机械收割时就地粉碎秸杆，待水源充足时田块进行旋耕栽种水稻。农民连续自留第6年的‘黄华占’稻种，自主育秧，人工插秧方式种于麦茬稻田，麦茬稻田未经过深耕晒田。自留第6 年的常规稻‘黄华占’当年所结的稻谷易提前脱落，经41对水稻特异性SSR 标记检测，显示所结稻谷不再是‘黄华占’，表明常规稻‘黄华占’在连续自留种多年后再播种，在大田生境作用下会发生物种变异，且其在田间生长后期表现为植株衰枯。

本研究分离主要获得4种致病菌，有稻黑孢菌、层出镰孢菌、木贼镰孢菌和禾谷镰孢菌。稻黑孢菌是世界范围内危害植物的重要致病真菌[10]，寄主范围广泛，能够侵染棉花[11]、芦荟[12]、铁皮石斛[13]、薄荷[14]、杂草类[15-16]等植物引起红褐、紫褐或黑褐色叶斑病；侵染植物茎杆引起杆腐病[17]，侵染果实引起黑斑病或褐斑病[8]。2013 年报道在广东稻区发现水稻稻叶褐条斑病，其病原鉴定为Nigrosporaoryzae[18]。本研究鉴定发现稻黑孢菌可危害水稻的叶鞘、茎杆和稻穗，危害症状与前人报道的相同。2016 年之前穗腐病在湖北稻区零星发生，笔者在鄂东南稻区采集穗腐病样本，分离获得穗腐病病原包括链格孢属真菌和稻黑孢菌[3]。比较浙江稻区（鉴定病原菌有层出镰刀菌、澳大利亚平脐蠕孢菌、链孢菌）[1,19]、新疆稻区（层出镰刀菌，新月弯孢菌、细交链孢菌）[20]、黑龙江稻区（链格孢菌、镰孢菌、青霉菌）[21]、江西稻区（厚垣镰刀菌、细交链格孢菌、香茅弯孢菌、稻黑孢菌）[2]、安徽稻区（层出镰刀菌、新月弯孢菌、细交链格孢菌、稻黑孢菌）[22]的穗腐病病原，发现引起穗腐病的病原真菌种类不同稻区具有多样性，也有一定的共性[23]。安徽、江西和湖北稻区的穗腐病病原菌都包含稻黑孢菌，浙江、新疆稻区的穗腐病病原菌都包含层出镰刀菌。2021 年采样于南漳县的水稻样本，病状不同于典型的穗腐病。从病理角度分析，分离获得的致病菌中稻黑孢菌占52.4%，4种病原菌均可引起水稻叶鞘、茎杆、稻穗腐烂，谷粒发生褐变，温室人工接种出现典型的穗腐病症状。

本研究获得的4 种致病菌中有3 种同属镰孢菌。镰孢菌是植物重要的致病菌，能够引起植物维管束病害，导致病株茎干腐烂直至死亡[24]。禾谷镰孢菌是玉米茎腐病、小麦赤霉病的主要致病菌；层出镰刀菌是河南玉米穗腐病的优势致病种群[25]，作为优势致病菌可引起水稻穗腐[1]。木贼镰刀菌是引起橡胶树根部和茎基部腐烂致树势衰弱、叶片脱落、树梢发黄至枯萎死亡的致病菌[24]。

综上，南漳稻田不明原因的落粒、杆枯、穗腐及谷粒变色等不正常生长现象，其原因认为是农户自留第6 年的稻种（与第一代稻种相隔7 年）播于大田后对水稻的健康生长产生不良影响，在生长后期水稻生命力已衰弱，在适宜的气候条件下，穗腐病病原菌的加持下，田间水稻大面积出现稻杆、稻穗褐变腐烂、结实率差或不结实，谷粒易脱落、稻谷紫黑色，米粒杂色等病理或非病理的不正常生长现象。

70%唑醚·丙森锌和23%醚菌·氟环唑对致病菌菌丝的生长均有良好的抑制作用，与他人的研究结果有相似[26]，表明施用甲氧基丙烯酸酯类、三唑类单剂或复配药剂对稻田病害有防控作用。稻田的病原菌是否来自于土壤（育秧田还是麦茬轮作田），需作进一步的研究。王玉正等[27]根据既要控制病虫害增长又要保护生态的原则，利用正交法研究了药剂、烤田方式、施肥水平、水稻品种等13 种稻田主要可控因素对病虫害防控、水稻产量等综合效应，提出了水稻病虫害系统最优控制。正确选择和利用抗病品种[28]、科学管理及适期药剂防治有助于水稻的安全生产。