玉米籽粒皱缩突变体sh2019的分子标记初步定位

关海英 董瑞 刘铁山 刘春晓 何春梅 王娟 刘强 徐倩 张茂林 汪黎明

关键词：玉米；籽粒皱缩突变体sh2019；分子标记定位；表型分析；遗传分析

玉米是集食用、饲用及多种工业用途为一体的我国第一大作物，在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。随着我国人口数量的不断增加和人们生活水平的提高，对玉米产量和营养品质的要求日益提高。籽粒是玉米营养物质合成和储藏的主要器官，其发育是决定玉米产量、品质及经济价值的关键因素。挖掘控制玉米籽粒发育的关键基因，并解析其分子机制，对提高玉米产量和营养价值具有重要的理论意义。

籽粒发育缺陷突变体是研究玉米籽粒发育的良好材料，根据表型差异，大致可以分为6种类型：籽粒严重缺陷突变体，等突变体；籽粒皱缩突变体，等突变体。

本研究以前期发现的自然突变的玉米籽粒皱缩突变体sh2019为材料，与野生型玉米自交系M017杂交组配F2代分离群体，并对其进行表型鉴定、遗传分析和连锁分子标记初步定位，以期为后续sh2019基因的克隆及功能和突变机制解析奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

籽粒皱缩突变体sh2019是本课题组从田间回交改良育种材料中发现的，经过多代自交，其籽粒皱缩表型能够稳定遗传。本试验利用sh2019突变体与野生型玉米自交系M017进行人工杂交，F1代经自交获得F2代，用于表型鉴定、遗传分析和分子标记初步定位。突变体sh2019、自交系M017及用于遗传分析和基因初步定位的群体材料等，均种植于山东省农业科学院玉米研究所章丘龙山试验基地。

1.2玉米籽粒百粒重的调查方法

从F，代成熟果穗上随机挑选发育良好的野生型和sh2019突变籽粒，各取100粒，使用分析天平称重，重复3次，并计算平均值。

1.3玉米籽粒出苗率的调查方法

从F，代成熟果穗上随机挑选发育良好的野生型和sh2019突变籽粒各40粒，于2021年3月2日种在同一个培养盆里，放在光照培养箱里培养10天（培养条件为光照16h、温度28℃，黑暗8h、温度25℃），以胚芽鞘露出地面为标准统计出苗数。设置6个重复，并计算出苗率。

1.4遗传学分析

从F2代成熟果穗中任选3穗，对其种子进行表型鉴定，统计野生型和突变籽粒的数目，用统计学方法计算分离比并进行卡方检验。

1.5DNA提取、PCR扩增及电泳检测

DNA提取：取纯净水浸泡48h的种子或新鲜叶片，用组织研磨仪（TissueLyserⅡ，QIAGEN）磨碎至粉末状，取100mg利用快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321-03，TIANGEN）提取DNA。

PCR扩增程序：95℃预变性5min;95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸5min;4℃保存。

电泳检测：配制质量浓度为4.0%～5.0%的琼脂糖凝胶，按体积比1：10000（Gelred：瓊脂糖凝胶）加入无毒染料Gelred，7V/cm电泳90～180min；电泳完成后，拍照保存。

1.6基因连锁分子标记筛选及初步定位

利用本实验室保存的均匀分布在玉米基因组上的658对InDel和SSR标记，对M017自交系和突变体sh2019进行多态性分析；选取F2分离群体中各30粒sh2019突变籽粒和正常籽粒的DNA构建混合基因池，利用BSA（bulked sample analy-sis） 筛选可能与目标基因连锁的分子标记，初步确定目标基因所在位置。

2结果与分析

2.1成熟sh2019突变籽粒的表型分析

sh2019突变籽粒明显干瘪皱缩，胚乳填充不饱满（图1A），百粒重仅22.75 9，比野生型（40.30g）显著降低43.55%（图1B）；出苗率仅29.17%，显著低于野生型（95.83%），降幅达69.56%（图1C、D）。

2.2遗传分析

籽粒皱缩突变体sh2019与籽粒正常的自交系M017杂交，其Fi代籽粒表现正常，推测籽粒皱缩性状为隐性性状；用得到的F2代分离群体进行遗传分析，发现正常籽粒与皱缩籽粒的分离比符合3：1（表1）。表明突变体sh2019的籽粒皱缩表型由1对隐性核基因控制。

2.3连锁分子标记筛选

用本实验室合成的658对引物借助BSA法找到1个与目标基因连锁的多态性分子标记SSR74（表2），位于玉米3号染色体的长臂上。利用SSR74多态性分子标记对F，分离群体中213个sh2019突变单株的基因型进行检测，结合表型分析，发现有4个交换单株，分别为2-2、2-4、2-14、3-12（图2A）。

进一步开发与sh2019基因连锁的分子标记，新筛选到3个多态性标记SSR78、Chr3-11712和Chr3-12160（表2）。用这3个标记鉴定SSR74筛选到的4个交换单株的基因型，发现都没有交换单株。用这3个标记鉴定F2分离群体中其余209个单株的基因型，结果发现标记Chr3-12160有3个交换单株（2-5，3-6，3-13），标记SSR78和Chr3-11712都没有检测到交换单株（图2B、C、D）。

标记SSR74位于靠近着丝粒的一端，检测到的4个交换单株单倍型记为I：标记Chr3-12160位于靠近端粒的一端，检测到的3个交换单株单倍型记为Ⅱ；将目标基因定位在标记SSR74和Chr3-12160之间物理距离约为30.18Mb的片段内（图2E）。

3讨论与结论

在玉米常规回交改良育种过程中，我们发现了突变体sh2019，其籽粒发育缺陷，干瘪皱缩，胚乳不饱满，百粒重和出苗率显著降低，多代自交后该性状能够稳定遗传。本研究利用野生型玉米自交系M017与突变体sh2019组配的F1及F2群体对目标性状进行遗传分析，发现籽粒皱缩表型受1对隐性核基因控制：通过集团分离分析法筛选出4个多态性分子标记——SSR74、SSR78、Chr3-11712和Chr3-12160，通过检测F，分离群体中213个突变体植株的基因型，发现SSR74和Chr3-12160分别能检测出4个和3个交换单株，最终将sh2019基因定位在玉米3号染色体上SSR74与Chr3-12160标记间约30.18Mb的物理距离内。

已报道的玉米籽粒皱缩基因shl、sh4和bt2分别定位于玉米的9号、5号和4号染色体上，而sh2定位于玉米3号染色体上，位于sh2019所在的约30.18Mb定位区间内，sh2019与sh2是否为等位基因还需进一步实验确定。本研究结果可为开展sh2019基因的精细定位及相关突变机制解析和分子标记辅助育种利用提供重要依据。