外源水杨酸对越橘休眠期花芽抗寒性的影响

刘炳含 唐雪东 刘海瀛 范家赫 蔡佳欣 陈国双

关键词：越橘；休眠期；水杨酸（SA）；花芽；抗寒性

越橘为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccini-um）植物，其蓝果类型俗称蓝莓（blueberry）。该属植物种质资源较为丰富，是一类很有开发利用前景的多年生灌木果树，其黄酮类化合物种类很多，为本属植物的主要活性成分。因其果实味道鲜美，药用价值高，不仅可以直接食用，还可作为罐装品及冻品进行销售，在酿酒和制作果酱方面得到广泛应用。因此近年来我国越橘产业发展较快，栽培面积不断扩大。

越橘喜爱凉爽湿润气候及酸性且含水量稍高的土壤，适合东北地区栽植。但近些年来，吉林地区冬季严寒，降水量大幅下降，越橘极易在休眠期发生冻害，主要表现为越冬抽条，多表现在一年生枝条和多年生枝条全部干枯。而其花芽伤害率会随着枝条的失水抽条而大幅上升，从而影响翌年的花芽分化，直接影响越橘产量。如何安全越冬成为越橘培育发展的一项重要研究。

近年来，外源物质在缓解旱涝、盐渍、寒冷、高温、重金属等非生物逆境对植物造成的毒害方面具有重要的应用价值。应用外源物质来提高植物抵抗非生物逆境的方式，具有见效快、用量少、污染较少等特点，符合现代农业绿色可持续发展理念。水杨酸（salicylic acid，SA）是植物界普遍存在的一种小分子酚类物质。1828年德国科学家Johann A．Buchner从柳树皮中提取出少量淡黄色物质，并命名为水杨苷。SA与植物的各种抵御胁迫的关系一直是研究的热点，已经明确的是，SA可作为植物抗病反应所需的信号分子激活植物防御保护机制，在植物信号传导和抗逆反应中起着关键作用。

在寒冷逆境条件下，一般植物的生物膜结构、渗透调节物质、各种酶活性以及抗氧化物质含量等均发生变化，从而影响植物的正常发育，同时低温胁迫会促进活性氧的产生。在越橘‘北陆休眠期花芽抗寒性的研究中发现，随着温度的降低，花芽可溶性糖含量总体呈上升趋势，可溶性蛋白含量呈升一降一升的趋势。而适宜浓度的SA可以通过促进植物保护物质积累、抑制电解质外渗、提高植株体内抗氧化酶活性以及减轻植物细胞结构的变化来提高植物的抗寒性。在冷害条件下，王煜等发现0.05g．L-1SA能够提高水稻种子发芽率和活性指数，降低低温胁迫對细胞膜的伤害：同样的结论在舒英杰等对黄瓜萌发种子抗冷性的研究中也有体现。蔺经等在对山桃幼苗耐冷性的研究中发现0～8.0mmol·L-1SA处理后，过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加、丙二醛含量降低、脯氨酸含量增加，其中以8.0mmol·L-1的效果最佳。韩红霞在对油桃自然休眠的研究中发现，不同时期不同浓度外源SA处理对芽休眠解除的影响效果不同，说明SA对植物有浓度效应。还有研究表明外源SA不仅能影响植物的酶促反应机制，还可以同时参与调节抗坏血酸一谷胱甘肽循环这一非酶促反应机制，以此来提高植物的抗寒性；适宜浓度的外源SA能显著增强抗坏血酸过氧化物酶活性，提高抗坏血酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽的含量。但目前关于外源SA对越橘抗寒性影响的研究尚鲜见报道。本试验以六年生半高丛越橘品种‘北陆为材料，研究喷施不同浓度SA对休眠期越橘枝条上花芽各项抗寒性生理指标的影响，并进行主成分分析，以期为越橘休眠期管理提供低成本的抗寒技术和方法。

1材料与方法

1.1供试材料及试验处理

本试验在吉林农业大学东山C03冷棚内选择六年生半高丛越橘成年植株‘北陆作为供试材料，选取发育良好、长势相同且无病虫害的一年生休眠期枝条上的饱满花芽，于休眠前期（2021年11月21日）、休眠中期（2021年12月21日）、休眠后期（2022年1月21日）分3次分别向树体均匀喷布SA。设3个SA浓度梯度处理，分别为0.1mmol·L-1（A1）、1.0mmol·L-1（A2）、10.0mmol·L-1（A3），以清水为对照（CK）。每处理2株树，设置3次重复。每次喷施水杨酸7d后进行花芽取样，用于各项生理生化指标测定，共取样3次。

1.2测定项目及方法

各项生理生化指标测定均参考张治安等的方法，即可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白（SP）含量用考马斯亮蓝染色法测定，脯氨酸（Pro）含量用茚三酮染色法测定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定，抗坏血酸（AsA）含量用二联吡啶显色法测定，谷胱甘肽（GSH）含量用硝基苯甲酸（DTNB）显色法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性用氮蓝四唑（NBT）显色法测定，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚比色法测定，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性用过氧化氢显色法测定。

1.3数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据分析及作图，SPSS21.0软件进行数据的显著性分析（Dun-can's法）。

2结果与分析

2.1不同浓度外源SA对休眠期越橘花芽渗透调节系统的影响

2.1.1对花芽可溶性糖含量的影响 由图1可以看出，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽可溶性糖含量整体呈先上升后下降的趋势。喷施不同浓度SA后，休眠前期花芽可溶性糖含量与对照（CK）相比，均有不同幅度的上升，A2、A3处理可溶性糖含量分别为4.97%、4.74%，均显著高于CK（3.49%）。休目民中期，CK可溶性糖含量比休眠前期上升53%，A1高于CK但差异并不显著，A2显著高于其他各处理，A3显著低于其他各处理。休眠后期，CK可溶性糖含量比休目民前期上升22%，比休眠中期下降20%; A1显著高于CK，比休眠前期上升50%，比休眠中期下降5%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升17%，比休眠中期下降17%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降27%，比休眠中期下降24%。

2.1.2对花芽可溶性蛋白含量的影响由图2可以看出，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽可溶性蛋白含量整体呈先上升后稍微下降的趋势。休眠前期，A1、A2、A3处理可溶性蛋白含量均显著高于CK（0.53mg·g-1），A2与A3及A1与A3之间差异均不显著。休眠中期，CK可溶性蛋白含量比休眠前期上升43%：A1高于CK但差异不显著，比休眠前期上升25%：A2显著高于CK和A3，比休眠前期上升32%：A3略低于CK，但差异不显著，比休眠前期下降5%。休眠后期，CK可溶性蛋白含量比休眠前期上升11%，比休眠中期下降22%；A1高于CK但差异不显著，比休眠前期变化不明显，比休眠中期下降20%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升18%，比休眠中期下降10%;A3显著低于A1、A2，比休眠前期下降25%，比休眠中期下降21%。

2.1.3对花芽脯氨酸含量的影响由图3可知，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽脯氨酸含量整体呈先上升后下降的趋势。休眠前期，A2脯氨酸含量显著高于CK（8.39ug·g-1），A1、A3与CK差异不显著。休眠中期，CK脯氨酸含量比休眠前期上升32%；A1与CK差异不显著，比休眠前期上升37%; A2脯氨酸含量为13.89ug·g-1，显著高于其他各处理，比休眠前期上升47%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降15%。休眠后期，CK脯氨酸含量比休眠前期上升13%，比休眠中期下降14%；A2显著高于其他各处理，比休目民前期上升37%，比休眠中期下降6%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降34%，比休眠中期下降23%。

2.1.4对花芽丙二醛含量的影响由图4可知，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽丙二醛含量整体呈先上升后稍微下降的趋势。休目民前期，各处理花芽丙二醛含量均显著低于CK（2.76umol·g-1）。休眠中期，CK花芽丙二醛含量比休眠前期上升27%：A1显著低于CK，比休眠前期上升28%：A2显著低于其他各处理，比休眠前期上升18%;A3显著高于其他各处理，比休眠前期上升61%。休眠后期，CK花芽丙二醛含量比休眠前期上升6%，比休眠中期下降16%：A1显著低于CK，比休眠前期上升12%，比休眠中期下降13%：A2显著低于其他各处理，比休眠前期上升12%，比休眠中期下降4%：A3显著高于其他各处理，比休眠前期上升32%，比休目民中期下降18%。

2.2不同浓度外源SA对休眠期越橘花芽酶促反应机制的影响

2.2.1对花芽超氧化物歧化酶活性的影响由图5可知，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽SOD活性整体呈先上升后稍微下降的趋势。休眠前期，各处理花芽SOD活性与CK（244.80 U·g-1）相比均有提高，A1高于CK但差异不显著，A2、A3均显著高于CK。休目民中期，CK花芽SOD活性比休眠前期上升56%；A1显著高于CK，比休眠前期上升58%;A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升68%;A3显著低于其他各处理，比休目民前期上升5%。休眠后期，CK花芽SOD活性比休眠前期上升22%，比休眠中期下降22%：A1显著高于CK，比休眠前期上升24%，比休眠中期下降22%;A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升27%，比休眠中期下降25%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降9%，比休眠中期下降14%。

2.2.2对花芽过氧化物酶活性的影响由图6可知，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽POD活性整体呈先上升后稍微下降的趋势。休眠前期，与CK（5.70 U·g-1）相比，喷施不同浓度SA各处理花芽POD活性均有提高，A1高于CK但差异不显著，A2显著高于其他处理，A3显著高于CK和A1。休眠中期，CK花芽POD活性比休眠前期上升60%；A1显著高于CK，比休眠前期上升65%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升59%;A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降6%。休目民后期，CK花芽POD活性比休眠前期上升35%，比休眠中期下降16%；A1高于CK但差异不显著，比休眠前期上升32%，比休眠中期下降20%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升35%，比休眠中期下降15%;A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降28%，比休眠中期下降24%。

2.3不同浓度外源SA对休眠期越橘花芽非酶促反应机制的影响

2.3.1对花芽抗坏血酸含量的影响由图7可以看出，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽抗坏血酸含量整体呈先上升后下降的趋势。休眠前期，喷施不同浓度SA各处理花芽抗坏血酸含量与CK（44.59ug·g-1）相比均有不同幅度的上升；A2处理花芽抗坏血酸含量为56.19ug·g-1，显著高于其他处理。休眠中期，CK花芽抗坏血酸含量比休眠前期上升53%：A1与CK无显著性差异，比休眠前期上升44%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升39%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降10%。休眠后期，CK花芽抗坏血酸含量比休眠前期上升24%，比休眠中期下降19%;A1与CK无显著差异，比休眠前期上升15%，比休眠中期下降20%：A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升25%，比休眠中期下降10%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降22%，比休眠中期下降13%。

2.3.2对花芽谷胱甘肽含量的影响由图8可以看出，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽谷胱甘肽含量整体呈先上升后下降的趋势。休眠前期，喷施不同浓度SA各处理花芽谷胱甘肽含量与CK（163.71ug·g-1）相比均有不同幅度的上升，A1与CK无显著差异，A2显著高于其他处理，A3显著高于CK和A1。休眠中期，CK花芽谷胱甘肽含量比休眠前期上升43%：A1显著高于CK，比休眠前期上升47%;A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升37%;A3顯著低于其他各处理，比休眠前期上升17%。休眠后期，CK花芽谷胱甘肽含量比休眠前期上升35%，比休眠中期下降5%;A1与CK无显著差异，比休眠前期上升37%，比休眠中期下降7%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升32%，比休眠中期下降3%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期下降4%，比休眠中期下降18%。

2.3.3对花芽抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

由图9可知，在整个休眠过程中，随休眠深度的变化，花芽APX活性整体呈先急剧上升后稍微下降的趋势。休眠前期，喷施不同浓度SA处理中A1、A2花芽APX活性与CK（1508.33 U.g-1）相比均有提升，但A1与CK差异不显著：A2显著高于其他处理；A3显著低于其他处理。休眠中期，CK花芽APX活性比休眠前期上升247%：A1显著高于CK，比休眠前期上升271%：A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升405%；A3显著低于其他各处理，比休眠前期上升130%。休目民后期，CK花芽APX活性比休眠前期上升72%，比休眠中期下降50%；A1与CK无显著差异，比休眠前期上升96%，比休眠中期下降47%；A2显著高于其他各处理，比休眠前期上升362%，比休眠中期下降8%：A3显著低于其他各处理，比休眠前期上升67%，比休眠中期下降27%。

3讨论

当植物进入休眠期，其体内各渗透调节系统、抗氧化系统均会随着冬季温度的变化发生变化，植物通过自身形成的渗透调节能力抵御严寒。喷施适宜浓度的水杨酸（SA）能够提高植物对低温的抵抗能力，帮助植物更安全地度过休眠期。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质，它们的含量与抗寒性之间有着密切关系。多数研究证明，植物在低温期间，细胞内渗透调节物质含量与抵抗低温能力之间存在明显正相关。本试验中，越橘花芽中的Pro、SS、SP含量随着休眠时间的变化呈先明显上升后稍微下降的趋势，休眠中期达到最高；外施适宜浓度的SA促进这些物质的积累，从而提高越橘花芽细胞膜的渗透保护能力，缓解低温对越冬越橘的伤害：而过高浓度的外源SA会破坏植物的渗透调节系统，反而加重低温伤害。韩红霞对油桃休眠期以及张烨对低温胁迫下玉米幼苗的研究中也得出相似结论。

植物在遭受低温等非生物胁迫时会积累大量的活性氧，加速体内0的产生速率，加快细胞膜脂过氧化过程，进而增加MDA含量，使植物细胞膜结构遭到严重破坏。SOD、POD等抗氧化酶可以维持膜结构的完整性并且降低活性氧自由基对膜的攻击。适宜浓度的SA可以通过诱导提升SOD和POD活性而提高植物的抗寒性。本试验中，越橘花芽SOD、POD活性休眠前期迅速上升，休眠中期活性达到最高，后缓慢下降，而韩红霞在油桃试验中得出酶活性休眠中期最低，这可能是由树种不同所导致：但适宜浓度SA处理下各时期花芽酶活性均高于对照组，所得结果与其具有相似性。适宜浓度的SA可以降低各时期花芽内的MDA含量，说明抗氧化酶系统积极响应低温胁迫对越橘花芽的伤害：高浓度的SA使其MDA含量不降反增，细胞膜结构破坏加重。这与樊国华等在外施SA对低温胁迫下草莓抗寒性影响研究中所得的结果（各试验组MDA含量均高于对照组）不同，可能是由本试验所用材料处于休眠期且取样时间也不同所致。

抗壞血酸一谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统是植物体内清除活性氧自由基的重要途径，谷胱甘肽（GSH）是植物体内有效的非酶抗氧化剂，能使膜蛋白结构稳定，它通过Halliwell-Asada途径清除过氧化氢，防止与修复膜脂过氧化造成的损伤；在防御自由基对膜脂的过氧化中起重要作用。APX是植物体内清除过氧化氢的重要酶，在逆境胁迫中具有重要的抗氧化作用。SA能够通过上调AsA-GSH循环，从而提高植物的抗逆性。本试验中，越橘花芽APX活性、GSH含量和AsA含量休眠前期均迅速上升，休眠中期达到最高值，后有所下降，A2处理（1.0mmol·L-1SA） APX活性更是在休眠中期成倍增加，说明A2处理显著增加越橘花芽的抗寒性；高浓度SA处理各时期AsA和GSH含量以及APX活性均低于对照，说明AsA-GSH循环被抑制。这与李学玲、黄志等研究所得到的结果相同，即SA处理能提高低温胁迫后李花与枇杷幼果的GSH和AsA含量并提高APX活性。

4结论

外施水杨酸（SA）可以有效缓解休眠期越橘所受到的低温伤害，促进渗透调节物质含量增加，上调酶促反应机制与非酶促反应机制，从而提高越橘抗寒性，并且具有明显的浓度效应，以外施1.0mmol·L-1SA对缓解越橘休眠期低温伤害的效果最好。