抗生素在土壤颗粒态有机质纳米尺度上空间分布的检测方法研究

谢寅雨 刘兴华

关键词：抗生素；土壤颗粒态有机质；空间分布；纳米尺度；纳米离子探针

我国是抗生素的生产和使用大国，抗生素被广泛应用于人类医疗和养殖业，被使用的抗生素中40%～60%会以母体药物或代谢产物的形式通过粪尿排泄进入环境中。抗生素进入环境后会继续迁移、转化，还会诱发抗性基因的传播，危害生态系统和人体健康．2022年3月生态环保部将抗生素列为四种新型有机污染物之一。抗生素进入土壤中会被吸附，吸附过程受土壤组分及理化性质的影响，尤其是土壤有机质在抗生素吸附过程中起重要作用。土壤颗粒态有机质（particulate organic matter，POM）是有机质的重要组分，刘兴华在黄河三角洲地区沿由海到陆演替过程采集10种不同土地利用类型的土壤，包括沿海无植被荒地、盐生植被湿地和旱地等，对不同土壤中的POM进行分离提取，研究结果显示湿地土壤中POM分配系数最高达38%。POM是由植物残体、菌丝体等轻组有机质组分组成的有机无机复合体，是土壤中活性较高的有机碳库，受其来源和分解程度的影响，POM具有复杂的形态形貌结构，比如比表面积和丰富的内部孔隙等结构特征。POM容易被菌群和黏粒矿物吸附形成团聚体，优先富集在土壤团聚体表面，成为重金属、抗生素等土壤污染物的吸附媒介。因此，假设在纳米尺度上抗生素在POM表面的分布特征呈异质性且受土壤有机质形貌和组分的影响，当土壤环境改变时，吸附了抗生素的POM会随其周转而分解或释放。在有机质周转过程中POM形成粗糙的、多孔的、松散的结构，同时这些位置吸附的抗生素可能会释放到环境中或者重新被新的吸附位点吸附固定。因此，POM吸附的抗生素是否会再次释放对环境产生二次污染很大程度上取决于其在POM上的吸附位点或者固定组分。然而，迄今为止，没有相关的研究阐述上述假设。

我们在前期的研究中发现，POM在土霉素吸附过程中起重要作用，其主要吸附机制为氢键、阳离子交换、表面分配等，POM的比表面积和含氧烷基碳在吸附过程中起主导作用。环丙沙星是喹诺酮类抗生素中最为常用的一种抗生素，其性质比如键、疏水性等与土霉素存在很大差异．性质上的差异可能会使其在POM上的吸附机制不同。至今，环丙沙星在POM上的吸附机制，尤其是在纳米尺度上POM的空间异质性对吸附抗生素的作用尚未见定量研究方面的报道。因此，基于上述假设和前期研究基础，本研究提出了采用纳米离子探针技术和稳定性同位素技术相结合的方法，可以在纳米尺度上系统地定量分析环丙沙星在POM上的分布特征，为探究POM吸附环丙沙星的主导组分，明确颗粒态有机无机复合体中有机质组分和矿物组分在环丙沙星吸附过程中的重要性提供切实可行的实验手段。

纳米离子探针技术广泛应用在材料学、地质学、天体化学和微生物学等领域，近年来逐渐被学者引入到土壤学研究中。但是纳米离子探针技术在土壤学中应用时需要使用环氧树脂等有机包埋剂，经过剖光，将切片表面制作平整，然后用扫描电子显微镜近边X射线吸收精细结构光谱，来分析土壤有机质中的碳分布。这一过程会破坏POM的形貌结构，而且鉴于抗生素是有机污染物，用此方法无法直接区分哪些碳的分布来源于土壤有机质，哪些来源于抗生素。因此，若要阐明抗生素等有机污染物在土壤有机质中的分布特征，需要解决以下几个难题：首先，如何在切片制作过程中保护POM的空间结构不被破坏：其次，如何区分有机污染物和土壤有机质中的碳：再次，为避免外源碳干扰，制作切片过程中不能选用有机树脂等作为包埋剂：最后，土壤有机质的超薄切片质轻、易变形，切片转移过程中需保证切片的完整性和平整性。基于以上几个难题，本试验采用纳米离子探针技术结合稳定性同位素技术建立了抗生素在POM纳米尺度上空间分布的检测方法，以实现在纳米尺度上探究抗生素在土壤POM上的分布特征的目的。

1材料与方法

1.1样品采集

本研究采样点选择在黄河三角洲地区的无植被荒地、盐生植被湿地和旱地（玉米和小麦轮作的旱地区）。2020年采集无植被荒地、芦苇湿地和农用地的表层土壤（0～20cm）样品共15个，带回实验室，剔除掉其中的碎石、贝壳、植物残体等后风干，待用。

1.2试剂和设备

采用从美国剑桥同位素实验室购买的13 C稳定性同位素标记的环丙沙星抗生素（ CAS：2483830-12-0，纯度>98%）。

莱卡超薄冷冻切片机（FC7-UC7，德国），复旦大学高分子科学系聚合物分子工程国家重点实验室提供；NanoSIMS（Cameca NanoSIMS 50L），中国科學院地质与地球物理研究所纳米离子探针实验室提供；场发射扫描电镜（Hitachi S-4800），中国科学院烟台海岸带研究所提供。

1.3土壤颗粒态有机质分离提取

土壤颗粒态有机质的提取参考文献[7]的方法，并结合本研究中供试土壤的性质进行优化。首先，将土壤样品湿筛分为大团聚体、微团聚体和矿物结合态组分。准确称取20g土壤加入100mL离心管中，缓慢加水至水土比约为2：10然后将套筛包括2mm、250um和53um筛浸入超纯水中，将离心管缓慢倒置在2 mm筛内的水面以下，直至土样完全沉人套筛中。匀速移动套筛，得到三层筛子中的组分，风干，待用。

进一步将大团聚体和微团聚体进行密度分级，称取5g样品于100mL离心管中，加入密度为1.85 g/cm3的Nal溶液，固液比为1：7，充分混匀，过滤分离出POM，重复上述步骤，直至完全分离。分离的POM用超纯水反复洗去盐分离子，风干，待用。

1.4抗生素吸附试验

准确称取0.100gPOM于聚四氟乙烯离心管中，加入13C稳定性同位素标记的环丙沙星抗生素，浓度为40mg/kg，25℃、200r/min条件下振荡平衡24h，离心，收集POM，-20℃保存，用于制作切片后上机检测。

1.5POM的形貌结构检测

取POM样品1mg均匀平铺在硅片上，然后将硅片固定在载物台上，冷冻干燥，上机测试前进行喷金处理增加样品的导电性，上机观察样品形貌，进行选区拍照。

1.6POM切片制作过程

1.6.1POM包埋试验分别用以下几种方式进行POM包埋：（1）准确称取POM样品0.100g包埋在环氧树脂中，等待环氧树脂冷却固定成型，剖光，待切片；（2）准确称取POM样品0.100g压人铟箔中，待切片；（3）准确称取硫粉0.5g加入坩埚中加热直至硫粉熔融为透明状态，准确称取POM样品0.100g加入熔融态硫中冷却，待切片；（4）准确称取POM样品0.100g，加入超纯水1mL，用铝箔纸折成楔形，楔形锐角分别为20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、42°、45°、47°，将POM样品装入楔形模具中，-20℃冷冻成型。为避免抗生素解吸对试验的影响，同样取吸附了抗生素的POM样品0.100g，用吸附液做包埋剂，装入楔形铝箔模具中，冷冻成型，待切片。

1.6.2楔形模具锐角角度试验将POM依次装入用铝箔纸制作成的楔形模具，楔形角度分别制作为20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°，-20℃冷冻成型后，在液氮环境中用莱卡超薄冷冻切片机（FC7-UC7，德国）切片，保持楔形POM的锐角斜面与刀片方向一致。对比上述不同角度的楔形POM切片效果后，进一步缩小范围设置楔形模具的角度（42°、45°和47°），最终确定最适合的楔形模具的锐角角度。同时打开液氮罐的开关，调整液氮流速以保持切片的冷冻环境，避免切片边缘发生卷曲。

1.6.3转移POM超薄冷冻对比以下几种方式的POM切片转移效果：（1）POM超薄冷冻切片完成后，放入水中，用铜网（直径10mm）捞起漂在水中的POM切片；（2）在液氮环境中，用自制的睫毛笔蘸取POM切片分别转移至硅片（直径10mm）上，在显微镜下观察POM，切片单层放置，避免POM切片成簇或重叠在一起；（3）将一组硅片预先进行亲水处理，在液氮环境中，重复步骤（2）的过程，并将步骤（2）的硅片替换为亲水处理的硅片。

1.7NanoSIMS检测参数

使用NanoSIMS检测分析POM切片。检测的离子源：Cs+离子，初始激发能为6keV，电子束为1.2～3.8pA，二次离子激发能为8keV，横向分辨率为100～200nm，质量分辨率为7500～8000，13C和12Cl4N的等压干涉可以分别用12C1H和13C，分离。POM切片的扫描范围为20um×20um，每扫描一次切片侵蚀掉的厚度约为15nm。保留时间：15ms／像素，分辨率为512×512像素。

1.8NanoSIMS图像处理和分析

NanoSIM检测结果以二次离子12C、13C、12C14N、12C15N和160的图像形式输出，用ImageJ和插件MIMI Image分析处理，选区计算得到13C／12C的值。用非参数法（Kruskall-Wallis）分析POM吸附抗生素的参数差异，用R 2.8.02结合g-stat 2.8.0模块分析二次离子的统计结果，根据分析样点的距离函数在空间的改变，用变异函数描述参数的变异度，变异函数可用来计算所有可能产生的距离变异参数（试验横向分辨率考虑在内）。半方差计算采用下列公式计算：

1.9数据处理與分析

采用Image J软件和插件MIMI Image进行图像处理，Winimage堆叠软件进行校正，用MicrosoftExcel、Origin 9.0软件处理数据及绘图。

2结果与分析

2.1POM的形貌结构特征

利用扫描电子显微镜（SEM）观察POM的形貌特征（图1），可以看出，POM形貌呈现多样化，有块状．长条状、蜂窝状、颗粒状等，说明黄河三角洲地区土壤POM具有多样性。POM呈现不规则多孔结构（图1a）和中空结构（图1b），也有块状结构（图1c）。其中，长条POM来源于植物残体，如图1b为盐生植被湿地土壤中分离到的POM。植物残体是颗粒态有机质的主要来源。Bes-nard等通过扫描电子显微镜（SEM）观察森林土壤和玉米地土壤中闭蓄态POM和游离态POM的微观形貌，发现POM中明显具有可识别的植物残根、动物残体、真菌菌丝、孢子体以及动物粪便等结构体。这些不同的形貌结构特征，表明POM为松散的、无固定结构的有机质组分。POM形貌结构的分析结果为后续检测条件的选择和控制提供了数据基础。

2.2POM包埋剂的选择

由于POM为松散的、无固定结构的有机质组分，制作切片时需要选择合适的包埋剂。国内外土壤学者在使用NanoSIMS技术的研究过程中通常选择石蜡、树脂等包埋剂]，用包埋剂固定成型后切割，这些包埋剂中均含有机质（碳）。从图2中可以看出，在显微镜下环氧树脂包埋的土壤颗粒态有机质的组分与包埋剂融合在一起，在NanoSIMS检测过程中包埋剂中的碳也会被激发进而干扰土壤颗粒态有机质中激发的碳离子强度，因此环氧树脂等不能作为土壤颗粒态有机质的包埋剂。为了研究有机质切片，国外有研究者提出用硫或者铟箔做包埋剂，硫粉加热至高于159℃熔化形成双自由基黏度增加时，将有机质放人高温熔融态硫中，而抗生素加热超过40。C时会被分解。用铟箔固定有机质时需将有机质压入铟箔中，压入过程会破坏土壤颗粒态有机质的空间结构。上述结果表明，硫粉和铟箔均不适合作为研究抗生素在土壤颗粒态有机质空间分布的包埋剂。鉴于此，我们提出用水做包埋剂，即土壤颗粒态有机质吸附13C标记的抗生素后，离心取出有机质低温冷冻切片。试验结果显示，水中不含碳，不会引入外源碳干扰，水在常温下为液体，低温冷冻固态成型，不会破坏土壤颗粒态有机质的空间结构。试验对比结果显示用水做包埋剂是最优选择，结合使用13C标记的抗生素进行试验，可以有效地区分土壤颗粒态有机质中的碳和抗生素中的碳。

2.3POM超薄冷冻切片的模具角度

POM吸附13C同位素標记的抗生素后，避光保存。将POM依次装入用铝箔纸制作成的不同楔形角度模具中，-20℃冷冻成型后，在液氮环境中用莱卡超薄冷冻切片机将POM切成500nm厚的切片。结果显示，楔形锐角为40°和50°时，切片过程中有机质不容易崩碎，进一步将楔形锐角设置为42°、45°和47°进行切片，试验结果显示，楔形角度为45°（图3）时切割可以得到完整的、平整的POM超薄冷冻切片。

2.4POM切片的转移条件

在液氮环境中POM超薄冷冻切片制作完成后，切片一旦离开液氮环境，其中的包埋剂一冰会立即升华，升华过程中有机质切片会发生“卷曲”现象。试验结果显示，用铜网无法捞到平整的POM切片，且POM吸附的抗生素在水中发生解吸反应，因此铜网无法转移POM切片。为了顺利将切片转移至硅片上，需要满足两点：一是在冰升华之前将切片转移到硅片上平整放置：二是转移后有机质升华过程中避免发生“卷曲”现象。试验结果显示，在液氮环境中，用自制的睫毛笔沾取有机质切片转移至硅片（直径10mm）上，睫毛笔可将POM切片单层放置且不会破坏POM的空间结构（图4），有效避免了样品颗粒成簇或重叠在一起。

因此，为确保硅片离开液氮环境后，包埋切片的冰瞬间升华使有机质切片服帖的粘在硅片上，用睫毛笔将POM切片转移至预先进行亲水处理的硅片上，能有效避免有机质干燥过程中的“卷曲”现象。

2.5优化NanoSIMS检测参数

POM的形貌结构复杂，质轻且内部孔隙丰富，使用NanoSIMS检测分析POM切片，易被电子束侵蚀，经过反复调试一微调一初试验证，结果显示，初始离子激发能为6keV，二次离子引出压为8keV时，收集器可检测稳定的12C、13C、12C14N、12C15N、160二次离子，此时，POM的侵蚀厚度约为15nm。为避免12CH、12C14N、12C15N离子对13C、12C2H2、13C14N产生质量干扰，采用人口狭缝、孔缝和能量缝微调收集二次离子，实现四级调优，试验结果显示，以上检测参数为最优参数。

2.6抗生素在POM上的空间分布检测

经过计算和统计分析，抗生素在黄河三角洲地区土壤颗粒态有机质表面的分布如图5所示，可以看出抗生素在POM的表面呈现边缘富集和表面富集现象。

由于离子探针是破坏性分析技术，喷溅样品表面激发出离子，循环扫描POM可捕获多层二级离子。计算叠加的图像后得到剖面深度为150nm的POM上富集抗生素的分布，如图6所示，抗生素在POM剖面上呈表面富集和内扩散的分布特征。

进一步定量计算抗生素在POM剖面（150nm）上的表面分布量和内部扩散分布量，由内扩散方程拟合结果可知，94%的抗生素分布在POM表面，6%的抗生素通过内扩散进入POM内部（图7）。

3讨论与结论

土壤颗粒态有机质是土壤有机质中的活性有机碳库，具有复杂的空间结构特征，同时也是土壤污染物重要的富集库，尤其对抗生素具有重要的富集作用。土壤颗粒态有机质中富集的抗生素在颗粒态有机质周转过程中是否会再次释放而对环境产生二次污染是当下亟需明确的环境问题。本研究为土壤颗粒态有机质吸附的抗生素等有机污染物的空间分布特征提供了有效的研究方法，解决了以下几个技术难题：首先，提出了用水做包埋剂，利用水在不同温度条件下状态的改变，在制作土壤颗粒态有机质切片时保护了其空间结构的完整性，同时也有效预防了其他外源碳的干扰；其次，有关研究者通常在水中将切片转移到铜网上或者用胶水将切片粘在硅片上，而颗粒态有机质上吸附的抗生素在水中会发生解吸，因此不适合在水中转移，本研究根据土壤有机质的超薄冷冻切片具有质轻、易变形的特点，在液氮环境中，用睫毛笔将切片转移至亲水性硅片上，转移过程中保持了切片的完整性和平整性；最后，在优化的NanoSIMS技术条件下实现了在纳米尺度上阐明抗生素在土壤颗粒态有机质表面（94%）和内部（6%）分布特征的探索。同时本方法为土壤有机质中其他有机污染物的研究提供了一种新的思维方式，也为明确土壤有机质中有机污染物富集一释放过程带来的环境风险评估提供了方法学基础。