基于高通量测序的北柴胡根转录组SSR位点信息分析

王彬彬 高妍夏 郭欣慰 纪宏亮 王敬 王晖

摘 要 以北柴胡根为试材，采用高通量转录组测序方法，获得uingene序列信息，研究分析SSR分布、基元特征，设计、验证EST-SSR引物的有效性，为开发、丰富EST-SSR分子标记奠定基础。结果表明：从北柴胡根转录组中共筛选到31 176个SSR位点，分布于21 732条unigenes，出现的频率为20.08%，分布密度为3.20个/10 kb，主要重复基元类型以二核苷酸最为丰富，共21 056个，占SSR位点总数的67.54%；其次是单核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR的19.05%和12.07%；四核苷酸～六核苷酸重复基元数量均较少。不同核苷酸基序类型共有131种基元，重复基元次数在5～11次的数量最多，占SSR總数的91.7%，且长度基本小于15 bp，其中AT/AT和AC/GT这两种基元在二核苷酸中出现频率最高。2 064条和1 004条含有SSR位点的unigenes分别注释到GO和KEGG通路，获得注释的基因功能主要与基础代谢相关。从 22 090对具有潜在多态性的EST-SSR引物中，随机挑选20对引物对3个北柴胡种质DNA进行PCR扩增，扩增成功率最高达85%。北柴胡根转录组SSR位点丰富、可用性较强，将促进柴胡的种质资源评价及分子标记辅助育种等  工作。

关键词 北柴胡；根；转录组；SSR；位点信息

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）属于伞形科柴胡属多年生草本植物。目前全世界分布的柴胡属植物有200余种，中国有42种、17变种、7变型，占全世界种类的1/5以上［1］。柴胡以根部入药，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气的功效，用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等症状［2］。近几年，由于无序性采挖及生态环境破坏，野生柴胡已不能满足市场需求，栽培柴胡已成为最主要的市场供应来源。由于栽培柴胡种质混杂、异地调种、种植地域广，造成其种源混乱、药材质量参差不齐［3-5］，迫切需要对柴胡不同种质进行区分和鉴别，建立统一质量标准，消除柴胡临床用药带来的安全隐患。目前关于柴胡药材化学成分［6-7］、药理药效［8-9］等方面的研究较多，柴胡种质资源遗传多样性评价、分子标记辅助育种的研究则较少。

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）  标记是一类长度一般不超过200 bp、由  1～6个核苷酸为重复单位组成的一类短串联重复序列，因其具有多态性高、共显性和重复性好以及属间和属内种间保守性的特点，使其成为目前常用的分子标记之一［10］。目前，SSR标记已应用在多种药用植物如黄地老虎 ［11］、多花黄精［12］、半夏［13］、黄连［14］、杜仲［15］等的遗传多样性研究。虽然在柴胡属植物中已开发出一些SSR标记［16-20］，但目前可利用的SSR标记仍较少，不能满足当前在柴胡属植物间进行亲缘关系及遗传多样性分析等方面的需要。

本研究以北柴胡根为材料进行高通量转录组测序，基于测序数据，挖掘SSR位点并分析其分布及组成特征，同时将含有SSR位点的基因在GO、KEGG数据库进行功能注释，为柴胡遗传多样性分析、优良种质筛选以及品种选育等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

试验于2021年8月至12月进行，供试材料为北柴胡品种‘ZC2，将种子用清水反复淘洗，除去杂质及未成熟种子，蒸馏水浸泡12 h后捞出备用。将营养土撒在32孔穴盘中，压实浇透水，每孔放入10粒种子，覆土约1 mm，盖上透明盖，置于人工气候箱（温度：25 ℃，光照度为5 000 lx，昼16 h/夜8  h），每3 d喷水1次，种子出苗后，每孔只留1株幼苗，待其进入5叶期时，进行低温  （4 ℃）处理，在处理0 d、1 d、3 d后分别收集根部，每5株随机混合为一个生物学重复，每个时间点收集3个生物学重复，蒸馏水清洗根部后用锡箔纸包裹，迅速投入液氮速冻并保存于-80 ℃，备用。

从北柴胡‘ZC2植株采集健康、无病虫害叶片1～2片；从中国医学院科学院药用植物研究所试验地采集陕西种质（简称S′X，下同）、山西种质（简称SX，下同）北柴胡植株的健康、无病虫害叶片1～2片，上述材料均保存于-20 ℃。

1.2 转录组测序

将‘ZC2根部样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000测序仪（illumina，USA）进行转录组测序等工作。

1.3 SSR位点筛选

将组装得到的unigene作为参考序列，使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）软件搜索SSR位点，软件参数设置：单、二、三、四、五、六核苷酸SSR最少重复次数依次为10、6、5、5、5、5；获得SSR类型、出现频率、分布平均距离等信息。

1.4 含SSR位点的unigene 功能分析

将unigene进行功能注释和富集分类分析；注释数据库选择KEGG （https：//www.genome.jp/kegg）和GO （http：//geneontology.org），对比参数为 e＜1×10-10。

1.5 SSR引物设计与PCR扩增

使用Primer 3.0软件设计引物，随机挑选20对，由北京文达通科科技有限公司合成。使用通用基因组DNA提取试剂盒（Solarbio，D2100）提取3种北柴胡种质（ZC2、S′X、SX）叶片DNA。PCR扩增体系：1 μL 50 ng·μL-1 DNA模板，10 μL 2×Taq Master Mix，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；最后72 ℃延伸  5 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.6 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据统计、分析并制表，使用Origin 2022b软件的对应作图模块绘制三维柱状图、二维饼状图、双Y轴图等。

2 结果与分析

2.1 北柴胡根转录组SSR位点数量和分布

北柴胡根部转录组测序组装得到108 247条unigenes，序列总长为97 514 625  bp。共检测到31 176个SSR位点，分布于21 732条unigenes，平均每3 128 bp出现1个SSR，分布密度为3.20个/10 kb，SSR位点出现的频率为20.08%，其中有6 500条unigenes含有1个以上的SSR位点，含复合型 SSR 序列数为3 804个（表1）。SSR位点的分布特征表明，根转录组SSR位点较为丰富，其主要重复基元类型以二核苷酸为主，占SSR位点总数的67.54%，出现频率为19.45%；其次是单核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR数的19.05%和12.07%，出现频率依次为5.49%和3.48%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元类型数量较少，分别占总SSR数的0.89%、  0.14%和 0.31%。不同类型SSR的平均距离则与出现频率相反，二核苷酸类型平均距离最小，相距4.63 kb；五核苷酸类型平均距离最大，相距  2 267.78 kb（表2）。

2.2 北柴胡根转录组SSR基序重复类型和频率特征

北柴胡根转录组不同类型SSR重复次数出现的频率差异较大，随着各基元重复次数的增加SSR 位点数量逐渐降低（表3；图1）。SSR位点重复基元次数在5～11次的数量最多，占SSR总数的91.7%，其中，重复次数6次的SSR位点数（6 171个）最多，占总数的19.79%；其次是重复次数为10次（5 314个），占SSR总数的17.05%。单核苷酸重复次数均大于10次，所占比例为  19.05%，其中重复次数10～14次的频率较高；二核苷酸重复次数的变化范围均大于6次，所占比例为67.54%，其中重复次数6～12次的频率较高；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复次数的变化范围均大于4次，占SSR总数的比例分别为12.07%、0.89%、0.14%和0.31%，其中三核苷酸重复次数5～10次的频率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复次数较少，重复次数5～7次的频率均最高。

2.3 北柴胡根转录组SSR位点基序类型分析

北柴胡根转录组SSR位点中共有131种基元，每种核苷酸含有多种基序类型（表4，图2）。单核苷酸基序类型以A/T为主，有5 799个，占SSR总数的18.60%，基序C/G出现频率很低；二核苷酸基序类型有4种，以AT/AT为主，有  12 517个，占SSR总数的40.15%，占二核苷酸基序类型的59.40%，其次为AC/GT（6 339个）、AG/CT（2 141个）和CG/CG（59个），分别占SSR总数的20.33%、6.87%和0.19%。三核苷酸基序类型有10种，以ATC/ATG（686个）为主，占SSR总数的2.20%。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸基序的重复类型比较多，依次有26、30和59种，但其重复基元的个数在总数中所占比例较小，以ACAT/ATGT、AAAAT/ATTTT、ACTGGC/AGTGCC为主，分别占SSR总数的0.36%、0.01%和0.02%。

2.4 北柴胡根转录组SSR的可用性评价

研究表明，SSR位点的基序长度≥20 bp 时，其多态性较高；长度为12～19 bp时，SSR多态性明显下降；长度<12 bp时，其多态性极低［20］。北柴胡根转录组SSR基序长度分布范围在10～360 bp，其中，基序长度在10～11 bp的低多态性SSR位点有3 223个，占11.77%；长度在12～19 bp之间的中度多态性SSR位点有14 632个，占  53.45%；长度≥20 bp的高度多态性SSR位点有  9 518个，占34.77%，说明可以从该转录组中开发出具有高度多态性的SSR引物；当基序长度≥12 bp时，SSR分布频率随着基序长度的增加呈现下降趋势（图3）。

2.5 北柴胡根转录组含有SSR位点的unigene的功能注释

将含有SSR位点的21 732条序列在GO、KEGG数据库进行比对和功能预测，分别有2 064和1 004条unigenes注释到GO、KEGG数据库。

GO功能注释结果表明，含SSR的unigenes被注釋到44个功能组，分布于分子功能、细胞组分和生化过程3个类别（图4）。在分子功能类别中，789条unigenes得到注释，注释结果主要包括序列特异性DNA结合，泛素-蛋白转移酶活性，蛋白质二聚化活性。在细胞成分类别中，558条unigenes得到注释，注释结果主要包括核仁和后期促成熟复合物。在生化过程类别中，717条unigenes得到注释，注释结果主要包括蛋白质泛素化和DNA复制启动。

KEGG代谢通路分析中，含SSR的unigenes被注释到17个代谢通路，其中168条unigenes注释到了植物激素信号转导通路，此通路注释到的基因最多，占16.73%；其次是mRNA监控通路、植物MAPK信号通路和NOD样受体信号通路，分别有103条（10.26%）、97条（9.66%）和93条（9.26%）。

2.6 EST-SSR引物的设计及验证

22 090条unigenes设计得到66 270对EST-SSR特异性引物，从中随机筛选出20对不同SSR重复类型的引物用于引物的通用性和多态性评价（表5）。随机挑选的20对引物在S′X、ZC2和SX中依次有14、15和17对扩增成功，扩增成功率分别为70%、75%和85%，其中13对引物在3个样品中均扩增成功，3对引物均没有扩增成功，其余4对引物呈现一定的多态性（图6），初步表明上述SSR引物可靠性较好，且在3种北柴胡种质之间通用。

3 结论与讨论

通过北柴胡根部转录组测序获得108 247条unigenes，MISA软件共检测到31 176个SSR位点，分布于21 732条unigenes上，平均每3.13 kb出现1个SSR，即平均分布距离为3.13 kb，SSR位点出现的频率为20.08%，表明北柴胡转录组中SSR数量较为丰富。柴胡种间相比，SSR的出现频率会有所差异，柴胡种子转录组测序获得的244 194条unigenes中共鉴定出29 898个SSR位点，SSR的出现频率为12.24%，平均分布距离为6.46 kb［19］，这种差异可能与取材器官部位、建库软件等因素不同有关。与其他药用植物相比，北柴胡转录组SSR出现频率高于黄精  （9.73%）［12］、野三七（6.99%）［21］、金钗石斛  （12.90%）［22］，低于蒙古黄芪（31.26%）［23］、黄秦艽（30.73%）［24］、万寿菊（28.29）［25］等。SSR 出现的平均距离低于杜仲（1.75 kb）［15］、苦荞（3.04 kb）［26］、万寿菊（2.51 kb）［25］，高于膜荚黄芪（7.97 kb）［27］、太子参（14.7 kb）［28］、云黄连（9.48 kb）［14］。由此可见，不同物种转录组SSR位点存在明显差异，这可能与物种自身有关，还可能与转录组中unigene数量和长度、SSR筛选条件等有关［29］。

SSR重复基元类型是转录组的重要特征之一。研究表明，多数植物SSR位点的重复类型主要以二核苷酸和三核苷酸为主，但不同物种中重复基元类型及所占的比例会有所差异［10］。本研究中，北柴胡根部转录组SSR以二核苷酸重复为主，占SSR总数的67.54%，其次是单核苷酸  （19.05%）和三核苷酸（12.07%）类型，其中二核苷酸重复基元以AT/AT（12 517个）为主，占SSR总数的40.15%；三核苷酸以ATC/ATG（686个）为主，占SSR总数的2.20%，这与三岛柴胡全基因组、北柴胡种子转录组数据分析得到的结果相一致［17，19］，即SSR位点均以二核苷酸重复为主。在不同物种中，多花黄精（53.14%）［12］、野三七  （52.52%）［21］以二核苷酸重复为主，与本研究结果相一致；而人参果（58.78%）［30］、蒙古黄芪（31.26%）［23］以单核苷酸为主；裸花紫珠［31］以单核苷酸和二核苷酸为主；苏丹草［32］、黄地老虎［11］以单核苷酸和三核苷酸为主，蓝玉簪龙胆（54.7%）［33］、亚麻（60.1%）［34］以三核苷酸为主；半夏［13］、蒙药冷蒿［35］以二核苷酸和三核苷酸为主，上述研究结果表明，SSR位点的重复基元类型在不同物种间的分布有较大差异。此外，北柴胡转录组SSR位点中，长度在20 bp 以上的有9518个，占 SSR总数的34.77%，这部分多态性能比较高的 SSR 可能具有较高的应用价值。本研究随机挑选的20对引物，在3种北柴胡种质中扩增成功率为70% ～85%，有13对引物在3个样品中扩增产物长度与预期相符，4对引物呈现一定的多态性，说明开发的北柴胡基因组SSR引物具有较强的可用性。

本研究从北柴胡根转录组数据中挖掘到大量的SSR位点，并对其基元特征、分布、出现频率等进行分析，并进行了初步的可用性验证；不仅丰富了柴胡种质鉴定的SSR位点，同时可以为柴胡遗传多样性分析、分子标记开发及分子辅助育种提供一定理论参考。

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SSR Loci Analysis Using High-throughput Transcriptome Sequencing in Roots of  Bupleurum chinense

Abstract This study aimed to investigate the distribution and motif characteristic of SSR loci of unigenes in Bupleurum chinense DC by using high-throughput RNA-seq technology.Furthermore，EST-SSR primers were designed and the validity of these primers was evaluated to provide a foundation for enriching and developing  valuable molecular markers.The results indicated that a total of 31 176 SSR loci were  identified from 21 732  unigenes，with an SSR  occurrence frequency of 20.08% and an SSR density of 3.20 SSRs per 10 kb.As the predominant repeat type，di-nucleotide repeats accounted for   67.54% （21 056） of the  SSR loci，followed by the mono-nucleotide  and tri-nucleotide types，accounting for 19.05% and 12.07%，respectively.Tetra-nucleotide，penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeat types had a lower proportion.One hundred and thirty-one repeat motifs were detected in  the transcriptome data.Most of the SSR repeat number （91.7%）ranged from 5 to 11，and the length was less than 15 bp.Among the di-nucleotide motif types，the AT/AT and AC/GT motifs were the most abundant-type.Moreover，2 064 and 1 004 SSR-containing unigenes were functionally annotated by using Gene Ontology and KEGG pathways，respectively.Furthermore，those unigenes were involved inbasal metabolism.Furthermore，20 pairs of primers were designed and evaluated for PCR amplification ofthree B.chinense DC.Germplasms，with an amplification success rate of 85%.Overall，these results suggest that SSR loci are abundant and versatile in B.chinense DC，and can be utilized to accelerate the process of germplasm evaluation and molecular marker-assisted breeding.

Key words Bupleurum chinense; Root; Transcriptome; SSR; Loci information