基于SCoT分子标记的61份加工型黄瓜种质资源遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

王宏利 赵久成 赖淼 卢家仕 凌启昌 肖锦华 张华 付鑫锋

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0760

摘    要：为探明加工型黄瓜种质资源的亲缘关系及遗传多样性，为新品种选育提供理论依据，采用目标起始密码子多态性标记（SCoT）技术，以61份加工型黄瓜种质资源为试验材料，进行遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱。结果表明，从100条SCoT引物中筛选出8条扩增条带清晰、多态性高且重复性好的引物；利用筛选出的引物对61份黄瓜种质基因组DNA进行PCR扩增，共扩增出238个位点信息，其中多态性位点227个，平均多态性位点百分比为95.38%；采用NTSYS-pc 2.1软件计算得出供试的61份材料间的遗传相似系数分布在0.588～0.920之间，遗传相似系数最小的材料分别是34号与55号，二者在瓜色、叶片形状及果实形状方面存在较大差异，说明两者亲缘关系最远。基于遗传相似系数对其进行UPGMA聚类分析和树状图绘制，在相似系数0.735处，可将其划分为7个类群，说明61份黄瓜种质材料背景存在差异，但多数地域来源相近、生境相似地区的种质被聚在同一类群。利用2对特异性较大的引物SCoT 12和SCoT 83构建的DNA指纹图谱可单独鉴别出61份黄瓜种质资源，该图谱可为黄瓜分类与鉴定提供科学依据。

关键词：黄瓜；SCoT分子标记；亲缘关系；遗传多样性；DNA指纹图谱

中图分类号：S642.2           文献标志码：A                     文章編号：1673-2871（2024）04-036-10

Genetic diversity analysis and DNA fingerprinting construction of 61 processed cucumber germplasm resources based on SCoT markers

WANG Hongli1， ZHAO Jiucheng1， LAI Miao1， LU Jiashi2， LING Qichang1， XIAO Jinhua3， ZHANG Hua4， FU Xinfeng1

（1.Qinzhou Branch of Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Qinzhou Institute of Agricultural Sciences， Qinzhou 535000， Guangxi， China; 2. Institute of Flowers， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， Guangxi， China; 3. Agricultural and Rural Service Center of Napeng Town， Qinnan District， Qinzhou 535015， Guangxi， China; 4. Agriculture and Rural Service Center of Beitong Town， Pubei County， Pubei 535321， Guangxi， China）

Abstract： In order to find out the genetic diversity of germplasm resources of processed cucumber and provide theoretical basis for the breeding of new varieties. the genetic diversity of 61 processed cucumber germplasm resources was analyzed and DNA fingerprinting was constructed using SCoT technique. The results showed that 8 primers with clear amplification bands， high polymorphism and good repeatability were selected from 100 SCoT primers. A total of 238 loci of 61 cucumber germplasm genomic DNA were amplified by PCR using the selected primers， of which 227 were polymorphic loci， and the average percentage of polymorphic loci was 95.38%. NTSYS-pc 2.1 software was used to calculate the distribution of genetic similarity coefficients among the 61 tested materials between 0.588 and 0.920， and the material with the smallest genetic similarity coefficients was 34 and 55， respectively. There were great differences in melon color， leaf shape and fruit shape， indicating that the two were most loosely related. Based on the genetic similarity coefficient， UPGMA cluster analysis and tree diagram were performed. At the similarity coefficient 0.735， they could be divided into 7 groups. The results indicated that 61 cucumber germplasm material backgrounds were different， but most of the germplasm sources were similar， and germplasm from similar habitats were grouped together in the same group. Sixty-one cucumber germplasm resources could be identified by DNA fingerprinting of SCoT 12 and SCoT 83， which could provide scientific basis for classification and identification of cucumber.

Key words： Cucumber; SCoT molecular marker; Genetic relationship; Genetic diversity; DNA fingerprinting

收稿日期：2023-12-07；修回日期：2023-12-22

基金项目：广西壮族自治区科技先锋队“强农富民”“六个一”专项行动项目（桂农科盟 20230505）

作者简介：王宏利，男，农艺师，研究方向为黄瓜、百香果栽培及育种。E-mail：whl@gxaas.net

通信作者：付鑫锋，男，高级农艺师，主要从事黄瓜、百香果栽培与育种研究工作。E-mail：xfengf@gxaas.net

黄瓜（Cucumis sativus L.）是世界上主要蔬菜之一，也是我国保护地栽培面积最大的蔬菜作物，含有丰富的矿质营养和维生素，具有较高的食用价值、营养价值和药用价值，深受消费者的喜爱[1]。加工型黄瓜指主要用于腌制加工的黄瓜，以白皮或黄皮黄瓜为主，特点是瓜条顺直油亮、大小中等、色泽好。广西北部湾地区种植加工型黄瓜历史悠久，桂南地区的钦州市、北海市以得天独厚的自然条件，加工黄瓜种植面积常年维持在1万 hm2以上，其中尤以钦州市最具规模，种植面积占比可达70%。由于用于腌制加工的黄瓜没有专用品种，生产上主栽品种以农家自留种为主，造成多数种质资源的遗传背景不明确，品种同质化严重。且随着复种指数的提高，传统种植区域连作障碍凸显，退化变异严重，导致雌花率低、产量低、品相差、抗病性弱等问题突出，严重制约了加工型黄瓜产业的健康可持续发展。因此，建立快速有效的加工型黄瓜种质资源创新评价体系，发掘优异基因，是亟待解决的关键问题。

黄瓜新品种培育一般通过形态学鉴定，从大量种质资源中选择具有优良性状的亲本，通过杂交的方式培育新品种。黄瓜属于雌雄同株异花授粉植物，杂交后代中存在着较多的遗传变异，因此，只采用形态学、细胞学等传统方法分析黄瓜的遗传结构及亲缘关系具有一定的局限性，也无法直接全面解释其所具有的遗传多样性。随着分子标记技术的出现和发展，极大地加速了植物科学分子层面的研究，多种标记已被广泛用于作物种质遗传多样性研究[2]，为更好地研究黄瓜分子作用机制提供了新方法、新思路。目前，已有多种分子标记在黄瓜上得到了应用。Sahoo等[3]以11对ISSR引物对14个黄瓜基因型进行分子鉴定和遗传多样性分析，结果表明，14个黄瓜基因型间遗传相似性介于0.36～0.83之间，种间差异较大；Manohar等[4]使用23条RAPD引物和18条ISSR引物对印度卡纳塔克邦39份黄瓜种質资源的遗传多样性进行分析，筛选出CSC 83和CSC 71两份优质材料；Innark等[5]使用20个ISSR标记对40份黄瓜种质资源进行分析，系统发育树和主成分分析揭示黄瓜霜霉病与种质来源存在相关性；Mliki等[6]使用RAPD标记对来自阿尔及利亚、埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚和利比亚等5个非洲国家的26份黄瓜种质资源的遗传多样性进行分析，认为类群一中的埃及种质具有独特的遗传变异；刘亚婷等[7]以48份黄瓜种质资源为材料，利用SRAP分子标记对其进行鉴定，得出了形态学标记和SRAP分子标记的聚类结果存在较大差异的结论。姚丹青等[8]利用SNP标记对市场上销售的71份黄瓜品种进行遗传多样性分析，证明30个SNP位点的基因分型数据信息可以将71份黄瓜品种区分开来；史建磊等[9]以48份黄瓜自交系为试材，利用37对SSR引物对其进行聚类分析和指纹图谱构建，以探究华南型黄瓜种质的遗传多样性及亲缘关系。目标起始密码子多态性标记（start codon targeted polymorphism，SCoT）由Collard等于2009年首次提出，是近年来广泛用于种质鉴定和亲缘关系分析的新型分子标记，具有稳定性强、多态性高、成本低廉及引物通用性高等优势，在葡萄、核桃、铁皮石斛、柠檬等多种经济作物中得到了应用[10-14]，但在加工型黄瓜中尚未见到此类报道。笔者以加工型黄瓜主产区广西钦州市及从山东省青岛市、福建省福州市和厦门市等地收集来的61份优质种质资源作为研究对象，首次在加工型黄瓜上使用SCoT分子标记进行种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，旨在从分子生物学水平揭示加工型黄瓜种质资源遗传多样性信息，以期为加工型黄瓜种质资源分类、鉴定、保护和开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

笔者从广西钦州市、山东青岛市及福建福州市和厦门市等黄瓜种植基地收集了61份加工型黄瓜种质材料，于2023年2月10日在广西钦州市农业科学研究所久隆试验基地种质资源圃内进行穴盘（72孔，53 cm×27 cm）育苗，后移植于温室大棚内，每份材料各定植20株，定植间距50 cm，垄台高度15 cm，定植后，浇足定植水后3 d内禁止浇水，3 d后浇1次缓苗水，温室大棚内白天温度控制在24～28 ℃，晚上温度控制在13～15 ℃。在黄瓜结瓜期，每份材料采集植株嫩叶，液氮速冻后-80 ℃保存。黄瓜种质来源地及田间表型性状特征见表1。

1.2 黄瓜材料DNA基因组提取

使用天根多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN，Germany）从上述冻存的61份黄瓜叶片样本中分别提取10 μg总DNA，以DNA浓度、纯度及完整性为主要参考指标，使用Agilent2100 bioanalyzer对其进行质检，质检合格后，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物筛选及SCOT-PCR扩增

试验采用由北京擎科生物科技有限公司合成的100对SCoT通用引物序列，选用表型性状差异较大的黄瓜种质DNA对其进行筛选，以扩增条带清晰、多态性高、稳定性强为标准，筛选出特异性好质量高的引物对所有供试样品进行PCR扩增。PCR扩增体系为上下游引物（10 μmol·L?1）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，2×SG Green qPCR Mix 10.0 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火15 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸5 min，共35个循环。扩增产物放置于4 ℃冰箱中保存。取10 μL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用Bio-Rad全自动免染凝胶成像分析系统进行扫描拍照。

1.4 数据处理

对扩增后的SCoT条带的有无进行标注统计，在同一迁移水平下，有DNA扩增条带或弱带的赋值为1，没有条带的赋值为0，构建二进制数据矩阵。将数据矩阵导入分子生物学统计软件NTSYS-pc 2.1进行遗传相似系数计算、UPGMA聚类分析及绘制树状图。根据聚类结果，筛选出可鉴别供试材料的引物，使用该引物组合的二进制数据矩阵，手动构建DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 DNA提取

Agilent2100 bioanalyzer平台质检结果显示，提取的黄瓜DNA质量浓度在55～90 ng·μL-1之间，纯度较高，无蛋白质和RNA污染，无拖尾现象，质量符合SCoT分子标记试验要求（图1）。

2.2 引物筛选与PCR扩增

采用表型性状差异较大的34号和55号2份黄瓜基因组DNA对100对SCoT通用引物进行初步筛选，最终得到8对扩增效果较理想的引物（表2），利用该引物分别对所有黄瓜供试材料进行PCR扩增，扩增条带分子质量范围为100～5000 bp。共统计到清晰条带238条，其中多态性条带227条，多态性比率为95.38%；每对SCoT引物扩增条带变化范围在21～39条，平均为29.75条，多态性条带变化范围18～39条，平均为28.375条，每对SCoT引物扩增多态性百分率变幅为85.71%～100.00%。扩增条带数最多的引物为SCoT 12，共扩增出39条条带，最少的为SCoT 28，仅扩增出21条条带。以上结果说明筛选出的SCoT引物多态性检测效率较高且供试材料间的异质性较高，遗传多样性丰富，可用于对供试的黄瓜种质材料进行遗传多样性分析。图2为SCoT12引物对所有供试材料DNA的PCR扩增结果。

2.3 黄瓜遗传多样性分析

利用8条引物扩增的条带建立61份黄瓜种质资源的遗传相似系数矩阵，计算获得不同黄瓜种质材料的遗传相似系数在0.588～0.920之间，平均为0.754，其中，34号与55号种质材料的遗传相似系数最小，为0.588，他们在瓜色、叶片形状及果实形状方面存在较大差异，说明其亲缘关系最远。而46号与47号种质的相似系数最大，为0.920，他们在形态上较相似，说明其亲缘关系相近。

2.4 61份黄瓜材料亲缘关系分析

为了更直观地展示不同品种的亲缘关系，在获得遗传相似系数矩阵后，利用SHAN模块中的UPGMA对61份供试材料进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类树状图。由图3可知，8对SCoT引物的扩增结果在遗传相似系数为0.735处將61份黄瓜种质聚为7个类群，A类群为34号；B类群为16号；C类群为29号；D类群为6号和7号；E类群为2、3和10号；F类群为13和49号；G类群为其他材料。A类群只有一份34号黄瓜材料，单独聚为一类，该材料为从广东省深圳市引进的优质栽培种，在田间农艺性状表现为果实长圆筒形，果皮黄白色，叶缘呈全缘状且具有强雌性，与其余种质材料表现出明显的差异。2、3和10号聚为一类，其亲缘关系可能较近。2号为从山东省青岛市城阳区收集的材料，与3和10号材料中长棒果形和白绿色果色的外观保持一致。16、29和34号单独聚为一类，与其余58份黄瓜种质亲缘关系较远。在遗传相似系数为0.765处将G类群51份种质聚为3个亚类，a亚类包括6份种质，为1、4、5、15、17和37号，b亚类仅有1份种质，编号为18，c亚类包括44份黄瓜种质。其中，46号和47号材料遗传相似系数最大，可合理推断在广西灵山县佛子镇龙渊村种植的黄瓜品种为市场购买商品种而非广西钦州市本地自留种，且可能与阳江市农村农资店售卖的种子为同一品种。从总体聚类结果来看，地域来源相近、生境相似地区的广西原产黄瓜种质资源遗传关系较近，它们大部分被聚在同一类群内，具有一定的地域分布规律。

2.5 61份黄瓜种质构建DNA指纹图谱

通过筛选出的8对SCoT引物对61份黄瓜种质的扩增，结果表明，结合特异性引物的条带分辨率及重复性高低，比对发现引物SCoT 12和SCoT 83均可单独鉴别出61份加工黄瓜种质资源。以黑色表示该位点有条带，无色表示该位点无条带，使用引物SCoT 12和SCoT 83绘制该供试材料的DNA指纹图谱（图4和图5）。其指纹图谱反映了供试的每份种质都有唯一的扩增谱带，通过其指纹图谱可快速地区分黄瓜种质类型并将其准确鉴定出来。

3 讨论与结论

广西钦州市是全国加工型黄瓜的发源地，也是全国主要种植集中地，种质资源地方特征明显，品种混杂，如何对当地主栽优质品种进行分类、鉴定且有效利用所蕴藏的优异基因，开展分子设计育种，从而快速定向对其进行品种改良及创新，是当前黄瓜育种工作的方向。

DNA分子标记技术能有效地结合作物的表型和基因型对物种间的遗传多样性进行鉴定，且比传统的表型性状更科学准确，是检测种质资源遗传多样性的有效工具，可显著提高育种效率。目前用于辅助育种和种质资源遗传多样性评价较为广泛的分子标记有RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SCAR、IPBS、AFLP和SCoT等[15-18]。SCoT是一种基于翻译起始点位的新型目的基因分子标记，他不仅能获得与性状联系紧密的目的基因，而且能对性状进行跟踪。同其他类型的遗传标记相比，SCoT标记具有操作简单、成本低廉、多态性高、引物通用性强等优点，能有助于更好地从分子水平上揭示不同种质资源的遗传背景及种间的亲缘关系[19]。在笔者的研究中，使用SCoT分子标记分析了61份黄瓜种质资源，结果表明，8对SCoT引物共扩增出238条清晰的条带，其中227个具有多态性，多态性条带比率值为95.38%，高于前人利用其他分子标记对黄瓜相关种质进行遗传多样性评价的结果。张桂华等[20]以23份不同来源的黄瓜材料进行AFLP分析，多态性条带比率值为19.5%；王惠哲等[21]对4种不同类型28份黄瓜种质材料利用49对SRAP引物进行遗传差异分析，多态性条带比率值为46.5%；金庆敏等[22]以50份来自全国各地的黄瓜核心种质资源为试验材料，利用32对SSR引物进行遗传多样性分析，多态性条带比率值为77.1%。以上结果说明与其他类型分子标记相比，SCoT分子标记应用在黄瓜种质上具有丰富的多态性，检测出多态性位点较丰富，能为黄瓜种质的初步鉴定、遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建等研究奠定基础。

种质资源是种业原始创新的物质基础，突破性新品种的育成多来自于特异优良遗传资源的发现和利用。有研究认为生态环境的差异会导致作物种质在长期进化过程中逐步演化出不同的种群和变异种[23]。笔者研究的种质资源采集于自然气候条件差异较大的不同省份，气候的多样化和地形的错综复杂可能促使黄瓜种质具有更高的遺传多样性。聚类结果表明，从国内不同区域收集来的61份黄瓜种质材料可划分为七大类群，种质资源间的遗传相似系数分布在0.588～0.920之间。王蕾等[24]对来源不同的32份黄瓜栽培品种使用17对多态性高、条带清晰的SSR引物进行遗传多样性分析，遗传相似系数分布在0.560～0.947之间；姚丹青等[8]基于SNP标记对71份黄瓜品种进行遗传多样性分析，遗传相似系数分布在0.403 2～0.983 9之间；卢霞等[25]利用InDel标记对48份黄瓜自交系进行遗传多样性分析，遗传相似系数分布在0.44～1.00之间。笔者的研究结果与以上SSR、SNP及InDel 3种分子标记分析结果大体一致，都表明黄瓜种质资源间遗传多样性较为丰富。因此，在进行黄瓜种质资源创新利用时，为拓宽遗传基础的范围，应从华南和华北黄瓜主栽区气候条件差异较大的区域内开展优异种质的引进，充分挖掘和利用多样化地方品种和引进的外来优异种质，从而为黄瓜优良种质的筛选和改良提供种源支撑。

DNA指纹图谱集精确、简单快速和受时空条件限制小等优点，是鉴别作物品种、品系的有力工具，已广泛应用于多种作物的品种资源多样性和纯度鉴定研究。目前植物DNA指纹图谱的构建有引物组合法、单引物法和特征谱带法3种方式[26]。由于黄瓜种质资源具有较为复杂多样的遗传背景，基于黄瓜瓜色、瓜型和雌性强弱的传统形态学鉴定方法往往难以区分不同种质之间的遗传差异。笔者从8对扩增引物中筛选出SCoT 12和SCoT 83两对遗传多态性较高的SCoT引物，使用特征谱带法构建了61份黄瓜种质的DNA指纹图谱，每份种质都有其唯一对应的DNA指纹图谱。指纹图谱能有效地对黄瓜种质资源进行精准鉴定和评价，有助于发掘和利用黄瓜种质资源的遗传多样性，从而提高其品种选育的效率和成功率。

综上所述，笔者的研究明确了61份加工型黄瓜种质资源的遗传变异相近程度，使用的8对SCoT引物，共扩增出238个位点信息，其中多态性位点227个，具有较多的遗传信息，构建的指纹图谱能快速准确地鉴定不同黄瓜品种材料。研究结果为加工型黄瓜种质资源评价、鉴定和新品种选育奠定了重要基础。

参考文献

[1]   李亚航，施艳娥，丁卓，等．黄瓜主要农艺性状分子标记研究进展[J]．中国瓜菜，2023，36（10）：1-9．

[2]   吴仕蔓，娄兵海，陈传武，等．应用SSR荧光标记法构建22个柚类品种的分子身份证[J]．果树学报，2023，40（4）：605-614．

[3]   SAHOO T R，SINGH D K，SINGH N K．Genetic diversity analysis of cucumber （Cucumis sativus L．） genotypes based on ISSR markers[J]．Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry，2020，9（2）：2131-2136．

[4]   MANOHAR S H，HOSAKATTE N M，RAVISHANKAR K V．Genetic diversity in a collection of Cucumis sativus L．assessed by RAPD and ISSR markers[J]．Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2012，22（2）：241-244．

[5]   INNARK P，RATANACHAN T，KHANOBDEE C，et al．Downy mildew resistant/susceptible cucumber germplasm（Cucumis sativus L．） genetic diversity assessment using ISSR markers[J]．Crop Protection，2014，60：56-61．

[6]   MLIKI A，STAUB J E，ZHANGYONG S，et al．Genetic diversity in african cucumber （Cucumis sativus L．） provides potential for germplasm enhancement[J]．Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50：461-468．

[7]   刘亚婷，罗英，曾仁杰，等．黄瓜种质资源形态学标记和SRAP标记的遗传多样性分析[J]．中国农学通报，2017，33（18）：35-41．

[8]   姚丹青，楼坚锋，朱文莹，等．基于SNP标记的黄瓜遗传多样性分析[J]．上海农业学报，2017，33（1）：21-30．

[9]   史建磊，陈先知，王克磊，等．华南型黄瓜种质遗传多样性的SSR分析[J]．分子植物育种，2017，15（6）：2440-2449．

[10] COLLARD B C Y，MACKILL D J．Start codon targeted （SCoT） polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]．Plant Molecular Biology Reporter，2009，27（1）：86-93．