天然低共熔溶剂在植物提取物中的应用研究进展

■ 李成林 褚秀玲 苏建青

（聊城大学农学与农业工程学院，山东 聊城 252000）

集约化高密度的畜禽养殖长期使用抗生素，导致了严重的细菌耐药、抗生素残留和环境污染[1]。中华人民共和国农业农村部发布第194 号公告要求，自2020 年1 月1 日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。植物提取物已经在畜禽养殖中发挥了重要的作用，对于畜禽的健康养殖做出了重要的贡献[2]。2022 年8 月1 日农业农村部发布的《植物提取物饲料添加剂申报指南（征求意见稿）》明确规定，植物性提取物包括纯化提取物、组分提取物和简单提取物，活性成分包含有多糖、黄酮、皂苷、多酚和生物碱等，是未来替代抗生素的重要物质。

植物提取物主要是从植物中，特别是在中草药中提取获得[3]。常见的提取方法有热水浸提、超声辅助、酶辅助提取和二氧化碳萃取等，不论是哪一种提取方法，提取溶剂的种类、性能都对提取物的得率和功效具有显著的影响[4]。提取溶剂的筛选是提取工艺优化的重要环节。传统的提取多采用水、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等溶剂，特别是有机溶剂具有易挥发、有毒、易燃等特性，不仅对提取人员造成危害，还会造成环境污染，因此，寻找绿色、高效、低毒、环保的新型提取溶剂一直是科学家研究的热点之一。

Abbott 等[5]在2003 年首次提出低共熔溶剂（DES）的概念，由氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD）和氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA）以一定比例组成的混合物，混合后可以形成低熔点的透明均一稳定的溶液，溶液具有无毒无害、不易燃、制备简单、成本低等优势，可用于活性成分的提取。Choi 等[6]在2011 年首次提出天然低共熔溶剂（NADESs）的概念，NADESs使用的成分主要是天然成分，HBA主要使用氯化胆碱、甜菜碱和L-脯氨酸等，HBD通常使用尿素、醇、羧酸、糖等有机化合物，这些有机物通常属于天然产物，相对于传统的提取溶剂氯仿、丙酮等，NADESs具有无毒、可生物降解和可重复利用的优点，还能增加提取物的生物活性和稳定性，目前已经用于多种天然植物有效成分的提取上。文章围绕天然低共熔溶剂在植物提取物上的应用进展进行综述，旨在为其推广和应用提供指导。

1 NADESs

1.1 NADESs的制备及分类

NADESs的常用制备方法包括加热混合法和冷冻干燥法。前者是将HBD 和HBA 在一定温度条件下直接搅拌混匀获得[7]，后者则是将这两种物质分别制成水溶液之后再合并混匀，然后通过低温冷冻至透明黏稠时再进行干燥而制得[8]。根据合成NADESs 时使用的有机化合物的酸碱性，可以将NADESs 分为中性（pH=7）、酸性（pH＜7）、碱性（pH＞7）三大类[9]。

1.2 NADESs的性质

1.2.1 熔点

NADESs体系的熔点通常低于组成该体系任一成分的熔点。物质熔点的高低主要是由分子间作用力决定的，分子间氢键数量越多，分子间作用力越大，熔点越高，而NADESs 体系中形成了大量的分子内氢键，降低了分子间氢键形成的可能性，使得分子间作用力减弱，引起NADESs 熔点显著降低。NADESs 熔点低的特性有利于低温下进行提取操作，并且低温操作更有利于保护植物有效成分（如挥发性油）的作用[10]，这拓宽了NADESs在活性产物提取中的应用。

1.2.2 黏度

在室温下，大多数NADESs 都具有较高的黏度，这会直接影响提取效率，这可能是由于高黏度的NADESs 体系中形成了大量氢键网络结构，使多糖大分子以及多酚、皂苷等小分子在NADESs 溶液中的流动性降低，而导致目标产物的得率较低。另外，制备NADESs的原料种类及摩尔比和含水量、温度等[11]也会影响NADESs的黏度。目前在研究应用中主要是通过调节含水量来降低NADESs的黏度，提高传质速率，获得较高的提取率，通常含水量在20%～60%，不会改变NADESs的化学性质，但是可以明显降低其黏度。

1.2.3 溶解性

NADESs 具有优异的溶解性，主要是受NADESs溶液极性影响。NADESs 为极性溶剂，不仅可在其内部形成氢键，还可与溶剂（水、醇类等）形成氢键，从而使NADESs 表现出更强的溶解性，这在提高中药有效成分的提取效率中起着重要作用。

1.2.4 生物可降解性

高生物降解性是NADESs 的一个重要特性，也是践行绿色化学理念的关键所在。良好的生物降解性不仅可以减少对环境的污染，还能扩展NADESs 的应用领域。这一特性主要与制备NADESs 的组分大部分属于天然产物有关[12]，当以葡萄糖、甘油、乙二醇、尿素等为HBD 时，可在自然界中多种微生物作用（经过生物氧化或无氧酵解和磷酸戊糖途径等生物转化反应）下生成水、CO2以及其他小分子，其生物降解效果通常与NADESs的含水量、pH、温度等因素有关。

2 NADESs在植物活性成分提取中的应用

2.1 多糖

多糖主要存在于自然植物、动物和微生物中，是由酮糖、醛糖、木糖、果糖等十几种单糖通过不同糖苷键连接而成的天然高分子聚合物[13]，具有抗氧化、促免疫和调节肠道菌群等多种生理活性[14]。研究显示，国内外在生产实际中利用NADESs 提取植物多糖的工艺已十分成熟，并在食品和药品等多个领域得到广泛应用。

Xia 等[15]比较了3 种NADESs 结合超声辅助从安吉白茶中提取茶多糖，发现氯化胆碱和1，6-己二醇（摩尔比1∶2）为溶剂时，茶多糖的提取率可达19.18%，比采用常规热水提取的提取率（5.50%）提高了248.73%，这主要是因为NADESs 可形成氢键以诱导包括多糖在内的多种物质的溶解，从而提高了多糖的提取效率。Wang 等[16]利用NADESs 结合超声辅助酶解提取柴胡多糖，结果发现在以尿素与氯化胆碱（摩尔比1∶3）为提取溶剂、超声功率为400 W、加酶量（纤维素酶）为2.63%的条件下，柴胡多糖的提取率可达10.11%，明显高于传统水提取法的提取率（4.00%～6.00%），这归因于尿素与氯化胆碱的NADESs体系对纤维素比水对纤维素有更强的溶解能力，使该体系对柴胡粉末细胞的破坏程度大于水溶剂。且体外抗氧化活性表明，所得的柴胡多糖对1,1-二苯基-2-苦肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH）和2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐离子（2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt Ion），ABTS+）均有一定的抑制作用，清除率分别可达78.02%和95.01%（相同条件下VC 对DPPH 和ABTS+的清除率分别为91.22%，96.84%）。Wang 等[17]制备氯化胆碱和琥珀酸（Chcl-SA）（摩尔比1∶3）NADESs 用于提取冬虫夏草中的蝙蝠蛾拟青霉多糖（PHPS-D），提取率达12.78%，而常规热水提取法得到的多糖提取率（PHPS-W）仅为8.67%，这可能是由于Chcl-SA 具有适当的黏度和极性，降低了细胞表面的目标分子被氢键分解的阻力。此外，所得PHPS-D 可通过激活小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7 细胞）中相应mRNA 表达，在多种免疫因子的分泌方面表现出更好的性能。Zhang 等[18]评价了9 种NADESs 体系结合超声提取菖蒲叶多糖，并以超声提取多糖和水提多糖为对照，发现氯化胆碱和丙二酸（Chcl-Ma）摩尔比1∶4混合为溶剂时，多糖提取率最高（0.68%），明显优于常规热水提取（0.59%）和超声辅助提取（0.52%），可能是因为Chcl-Ma 固有的强溶解度会分解菖蒲叶片中细胞壁的化学键，加速了生物聚合物从原料粉末中释放，这在菖蒲叶多糖提取应用上具有重要意义。Zhang 等[19]使用亚临界水萃取法（SWE）辅助NADESs提取香菇多糖，发现以氯化胆碱和丙二酸（摩尔比1∶2）为溶剂提取多糖所得的提取率为（6.26±0.08）%，与SWE 和热水提取相比，提取率分别提高了19.24%和17.01%，而且研究表明该方法可以改变多糖的结构，使多糖分子量降低，形成更多的羟基，显著提高了多糖的DPPH 清除活性、羟基自由基清除活性和过氧化氢清除活性。从以上文献可以得出，NADESs 对多糖的提取效率明显高于传统溶剂水的提取效率，而且多糖的抗氧化活性更高。

2.2 生物碱

生物碱是植物体次级代谢合成过程中产生的一类复杂的碱性含氮有机化合物，是植物药用活性或毒性[20]的重要有效成分，其结构类别多样且生物活性广泛。药理研究表明，生物碱在抑菌消炎、抗病毒、抗菌等方面疗效显著[21]。

Yu 等[22]设计了一种微波辅助NADESs（乙酰丙酸-甘油-K2PO4）-乙酸乙酯双相体系来提取中药吴茱萸药渣中的生物碱，发现其提取率（757.71 μg/g）比传统甲醇的提取率（22.20 μg/g）高3 313.11%，研究发现，La-Gly 与吴茱萸碱之间是放热反应，有利于生物碱的提取，而乙酸乙酯与吴茱萸碱之间的相互作用力强于乙酰丙酸-甘油，使NADESs 相中的生物碱迅速转移到乙酸乙酯相，从而更有利于提取率的提高。He等[23]合成了15 种不同的NADESs 结合超声用于粉防己根中生物碱的提取，结果表明氯化胆碱和乙二醇摩尔比为1∶2 的NADESs 体系对总生物碱的提取率最佳，为20.59 mg/g，分别是甲醇、95%乙醇和水的2.2倍、3.3 倍和4.1 倍，这可能是因为生物碱中酚羟基的存在更易形成氢键[24]而更利于生物碱的提取。因此NADESs 可作为传统溶剂的绿色替代品，用以提取中药。Xun 等[25]首次采用NADESs 并以合成磁性分子印迹聚合物为吸附剂从苦参根中选择性提取和富集苦参碱，发现氯化胆碱和乙二醇（摩尔比1∶2）作NADESs 时提取率可达2.42～2.79 mg/g，明显高于传统乙醇浸提的提取率（1.31～1.43 mg/g），该提取方法对目标化合物表现出较好的溶解能力，并依据相似相溶原理可对其进行选择性富集，在提高提取率的同时也提高了目标化合物的纯度。Liu 等[26]对多种亲水性和疏水性NADESs 提取麻黄中麻黄碱型生物碱进行了筛选和比较，发现由氯化胆碱和木糖醇（摩尔比1∶5）组成的NADESs 获得的麻黄碱和伪麻黄碱的提取率分别为（47.67±1.81）%和（4.32±0.71）%，显著高于甲醇和酸化水（将经过处理的自来水中加入低浓度的氯化钠，在有离子隔膜式电解槽中电解后，从阳极一侧生成的具有高氧化电位、低pH 和含有低浓度有效氯的酸性水溶液称为酸性氧化电位水，又称酸化水。）作为提取溶剂时的提取率，这很可能是由于木糖醇的多个羟基引起大量氢键网络形成而表现出较高的提取能力。结果表明，NADESs 作为天然生物碱的绿色高效提取溶剂具有相当大的潜力。

2.3 黄酮

黄酮类化合物是一种以2-苯基色原酮为母核的低分子天然衍生物，主要分布在维管束植物中[27]。黄酮类化合物在植物中的类型多，且结构也十分复杂，主要可分为黄烷酮、黄酮醇、黄酮、异黄酮、橙酮、黄烷醇、花青素等[28]。黄酮类化合物具有多种生物学特性及药理作用，如抗炎、抗氧化、抗应激等[29]。

Shang 等[30]采用微波辅助NADESs 法提取紫苏叶中黄酮类化合物，发现氯化胆碱与苹果酸（摩尔比1∶1）NADESs体系提取的产率最高（72.54 mg/g），显著高于甲醇[（53.19±1.15） mg/g）]、乙醇[（51.28±0.97） mg/g]和水[（45.12±1.19） mg/g]作溶剂的提取率，这可能是氯化胆碱和苹果酸混合形成的溶剂可以与极性较低的类黄酮发生更好的相互作用，从而提高提取率。此外，该研究还证实了NADESs 组紫苏叶总黄酮可表现出更加优异的抗过敏活性、抑制亚硝化作用、抗氧化活性等生物活性。Feng 等[31]测试了16 种不同NADESs结合超声波提取文冠果黄酮，结果发现，使用1,4-丁二醇与乙酸（摩尔比1∶3）NADESs提取时总黄酮提取率可达30.37 mg/g，且所得提取物清除DPPH和ABTS 自由基的能力（IC50值分别为：3.18 μg/mL、0.51 mg/mL）显著高于甲醇提取物（IC50值分别为4.56，0.76 μg/mL）。Qin 等[32]使用超声辅助NADESs提取翠云草中的两种双黄酮类化合物（AME、ROB），发现在脯氨酸和乳酸（摩尔比1∶4）NADESs 为提取溶剂时AME 和ROB 的提取率较高，分别为（709.72±11.31） μg 和（145.13±9.77） μg，这主要是NADESs 独特的物理性质和与目标化合物之间的非共价相互作用力使得NADESs 对植物细胞壁具有裂解作用[33]，同时在超声波空化作用下[34]，加速了细胞中类黄酮的溶解，从而得到较高的提取率。另外，该提取方法所得提取物还对多种癌细胞表现出良好的抑制作用。Sui等[35]从40 种NADESs 中筛选出提取铁皮石斛黄酮效果最好的是氯化胆碱与乳酸（摩尔比1∶4）NADESs，总黄酮提取率达到（35.23±2.12） mg/g，远高于乙醇的提取效果（10.56±0.82） mg/g，并通过理化表征和分子模拟实验发现，氯化胆碱与乳酸NADESs 较好提取能力的关键在于氢键的数目和其结构的紧密度，且NADESs 不仅能在自身内部形成氢键，与芦丁分子之间也能形成氢键。通过大量的研究结果发现，NADESs 在提高植物中黄酮提取率的同时，还增强了黄酮的抗氧化活性和抗癌等药理作用。

2.4 多酚

多酚类化合物在中药植物中含量丰富，种类繁多，结构复杂，是一类具有多个酚羟基的酚类化合物及其相关衍生物的总称，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒等多种生物活性功能[36]。

Wang 等[37]分别使用6 种NADESs 提取木质纤维素中的多酚（结合多酚通常存在于木质素中，提取时可通过破坏木质素的结构释放多酚），发现氯化胆碱和草酸（摩尔比1∶1）提取的多酚收率为83.2%，纯度高达99.6%，其中酚羟基含量达8.33wt%，这主要归因于草酸能提供更加活跃的质子，可以促进木质纤维素中的多种共价键的裂解[38]，从而提高对多酚的提取率。另外，与商业多酚相比，使用NADESs 提取的多酚拥有更多的含氧活性基团，具有更优越的功能活性，同时还显示出很强的紫外线吸收能力，可用于加强对紫外线的屏蔽。Liu等[39]发现在制备的7种NADESs中，氯化胆碱-乳酸(摩尔比1∶2)结合超声提取硫华菊中总多酚的效果最佳（3.53±0.03 g GAE/100 g），比超声辅助乙醇提取率（2.92±0.07 g GAE/100 g）高出21%，可能是由于NADESs 中乳酸的羧基的极性更接近多酚化合物的极性，而更有利于目标多酚的溶解。Zhang 等[40]考察了8 种NADESs 提取蓝莓果渣中的多酚，发现氯化胆碱与1,4-丁二醇（摩尔比1∶3）提取效果最好，提取率为（41.56±0.17） mg GA/g，是使用70%乙醇提取率（32.30±0.32） mg GA/g的1.29倍。Vassilis等[41]在应用不同NADESs优化胡椒薄荷总多酚提取工艺的研究中发现，甘油和氯化胆碱（摩尔比2∶1）提取所得的总多酚提取率为（72.78±7.14） mg GAE/g，分别比水和60%乙醇的提取率高32%和40%，且所得提取物可在一定条件下直接应用于药品或化妆品。从目前的研究结果发现，NADESs 作为新型绿色的提取溶剂，与传统提取溶剂如水、乙醇等相比，提取效果更佳，能优化植物有效成分提取工艺。

2.5 皂苷

皂苷是一类苷元为三萜或甾烷类化合物的天然糖苷类物质，主要分为三萜皂苷和甾体皂苷，广泛存在于中药植物中，如人参、西洋参、桔梗、三七、灵芝、黄芪等。大量研究表明，皂苷具有降血压、抗炎、抗氧化、增强免疫等作用[42]。

Liu 等[43]制备了10 种以氯化胆碱为基础的NADESs结合超声辅助萃取重楼皂苷，结果发现，超声辅助（UAE）氯化胆碱和N，N'-二甲基脲（摩尔比1∶2，含水量20%）NADESs 对重楼皂苷的提取率可达13.520 mg/g，是常规提取方法提取率的1.338～3.229倍，这可能是因为氯化胆碱和N，N'-二甲基脲NADESs 具有较大的极性，可以改变重楼皂苷的溶解度[44]。Tu 等[45]从选用的18 种NADESs 结合超声提取人参皂苷中发现，氯化胆碱和尿素（摩尔比1∶2，含水量20%）NADESs 体系的人参皂苷回收率高达95.0%～108.2%，比70%乙醇的提取率提高了31%，其原因是氯化胆碱和尿素组成的NADESs 亲水性和抗氧化活性更优[46]，而极性人参皂苷易溶于亲水溶剂，可促进氢键的形成，以实现提取和富集。Suresh 等[47]筛选了15种不同的乳酸基NADESs从延龄草中选择性提取甾体皂苷，发现氯化胆碱和乳酸（摩尔比1∶1）NADESs得到了更高的甾体皂苷提取率（114.4±8.2） mg/g，比传统的80%乙醇得率提高了53.72%，并且所得甾体皂苷对乙酰胆碱酯酶活性表现出很好的颉颃作用。Cao等[48]采用导向型四丙基溴化铵-乳酸（TPMBr-La）NADESs 体系提取文冠果壳中的总皂苷，其提取率高达67.01 mg/g，比70%乙醇的萃取效率（28.50 mg/g）提高135%，比水作溶剂的提取率（16.90 mg/g）提高296%，这主要归因于溴离子可以将皂苷上的羟基H原子与溶剂乳酸的羟基连接起来，减少皂苷分子周围的空间，形成更多的氢键和更稳定的非共价键作用[49]，从而更有利于总皂苷的提取。此外，所得总皂苷对DPPH 和ABTS+自由基的清除能力明显优于醇提皂苷。Cheng 等[50]使用超声辅助NADESs/石油醚双相水解法制备薯蓣皂苷元，结果表明，在苄基三甲基氯化铵和草酸（摩尔比1∶6）NADESs/石油醚（摩尔比1∶6）的优化条件下，提取率最高为99.5%（15 min），可达传统方法（4 h）的99.5%，且反应时间缩短94%，这可能是由于苄基三甲基氯化铵与薯蓣素具有相似的结构和极性，并且作为氢键受体具有很强的相转移能力，而石油醚的使用减少了萃取过程中发生的副反应[51]，使得薯蓣皂苷元的得率得以提高。另外，该工艺将废水中的化学需氧量（COD）值降低到传统方法的1%，大大减少了对环境的破坏，是一种更高效、清洁的生产方式。NADESs不仅使皂苷的提取率得到提高，且对环境的污染程度更小，所得产物的稳定性也更高，因此，NADESs 有望成为一种更高效、绿色的提取溶剂替代传统溶剂应用于植物成分提取工业。

3 小结与展望

随着对新型绿色提取溶剂的深入研究，NADESs具有替代传统有机溶剂的趋势，NADESs 主要由初级代谢产物及其化合物组成，易生物降解，具有安全、成本低廉、操作简便、稳定性强的优点。但是目前的研究多限于实验室规模，需要通过进一步扩大临床试验，以达到产业化的目的。虽然NADESs来自于天然化合物，但是其提取的产物安全性试验目前研究较少，有待进一步深入研究。相对于传统溶剂，对于NADESs 提取物的高稳定性和高活性，具体的机理研究很少，需要加强。总之，作为一种新型的绿色提取溶剂，NADESs未来在植物提取物上具有较好的发展前景。