高效液相色谱法测定旋复花中槲皮素的含量

杨玲娟 焦成瑾 葛 勐 雍宝霞

(天水师范学院生命科学与化学学院，天水 741001)

旋复花为菊科旋复花属的一种多年生草本植物，其性苦、辛、咸、微温，具有降肺胃之气、消痰止咳、清热解毒、止血等作用。据文献报道[1]，旋复花中含有旋复花素、旋复花内酯，同时含有槲皮素、异槲皮素、咖啡酸、绿原酸、菊糖及蒲公英甾醇等多种甾醇类物质。研究表明，槲皮素具有抗癌、防癌、抗血小板凝聚、镇痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗过敏等多种生物活性，且对人体无毒[2]；同时槲皮素具有潜在的抗抑郁作用和增强记忆的功能[3]，因此槲皮素具有很高的药用价值。随着中药现代化的发展，含有槲皮素的旋复花在中医方面的应用也会越来越广泛，具有很高的药用价值。

据文献报道，已有人测定旋复花中旋复花内酯的含量[4]，但对于旋复花中槲皮素含量的测定仍未见报道。笔者采用高效液相色谱法对旋复花药材中槲皮素含量进行测定研究，为综合利用与开发旋复花的药用价值及质量监控提供重要的理论依据和实验参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Aglient 1100 LC型，配VWD紫外检测器，美国安捷伦公司；

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司；

槲皮素对照品：中国药品生物制品鉴定所；

旋复花：市售；

磷酸(0.2%)、盐酸(2.3%)：分析纯；

甲醇：色谱纯；

实验用水为重蒸去离子水。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸，体积比为65∶35，流速为1.0 mL/min；检测波长：370 nm；柱温：40℃；进样量：20 μL。

1.3 对照品溶液的配制

准确称取经五氧化二磷干燥至恒重的槲皮素对照品25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成0.5 mg/mL的槲皮素储备液。准确移取3.00 mL该溶液置于50 mL容量瓶中，定容至刻度配制成30 μg/mL的对照品溶液。取20 μL进样，槲皮素对照品色谱图见图1。

图1 槲皮素对照品色谱图

1.4 样品溶液的制备

准确称取经60℃干燥2 h后研磨并过80 μm(180目)标准筛的旋复花样品0.500 0 g，置于50 mL容量瓶中，准确加入甲醇20.00 mL、盐酸20.00 mL，于温度70℃、功率500 W、频率40 kHz条件下超声萃取60 min，取出冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，在1.2色谱条件下进样，样品色谱图见图2。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择

将槲皮素对照品溶液在200～500 nm范围内进行波长扫描，光谱显示在370 nm处有最大吸收峰，故测定波长选择370 nm。

2.2 流动相的选择

考察了不同比例的甲醇-磷酸(0.2%)流动相对分离效果的影响，当甲醇与磷酸(0.2%)的体积比为65∶35、流速为1.0 mL/min时，样品中槲皮素分离良好，且峰形对称。

图2 样品色谱图

2.3 柱温的选择

柱温对样品保留时间影响很大，同时对于分离效果也有影响。柱温过低，保留时间过长；柱温过高，对色谱柱影响很大，出峰过于密集，不能达到良好的分离。实验结果表明，柱温选择40℃时，样品中槲皮素的峰形较好，且与其它共存组分的分离效果好。

2.4 标准曲线的绘制

分别准确移取槲皮素标准储备液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00 mL置于7个50 mL容量瓶中，然后加入甲醇稀释定容至刻度，摇匀，配制成系列槲皮素标准工作溶液，经0.45 μm微孔膜过滤，移取20 μL溶液在1.2色谱条件下进样测定，记录色谱图。以槲皮素色谱峰面积Y对进样浓度X进行线性回归，得回归方程为Y=64.152X+79.332，线性相关系数r=0.999 9，线性范围为5.0～100.0 μg/mL。

2.5 精密度试验

准确移取槲皮素对照品溶液20 μL，在相同色谱条件下重复进样6次，峰面积分别为1 996、1 935、1 968、1 950、1 948、1 986，经计算峰面积平均值为1 964，相对标准偏差为1.2%。由此可见，方法的精密度良好。

2.6 重复性试验

准确称取0.500 0 g旋复花样品5份，按样品制备方法制成样品溶液，各取20 μL进样，5次进样的峰面积分别为809、808、803、804、798，平均值为804，相对标准偏差为0.5%(n=5)，由此可见该方法重复性良好。

2.7 回收试验

采用加标回收法，在已知含量的旋复花样品溶液中加入适量的槲皮素对照品溶液进行测定，测定结果见表1。由表1可见，方法的平均回收率为97.1%，说明该方法的准确度较高。

表1 回收试验结果

2.8 样品测定

准确称取0.500 0 g旋复花样品1份，按1.4方法制备样品溶液，在1.2色谱条件下进样测定峰面积，根据回归方程计算得槲皮素含量为3.42 mg/g。

3 结语

采用高效液相色谱法测定了旋复花中槲皮素的含量，该方法简便、准确、快速，为综合利用与开发旋复花提供了重要的实验依据，可作为旋复花质量控制的有效手段。

[1] 钱名坤,陈泽乃,秦国伟,等.线叶旋复花化学成分的研究[J].化学学报,1983,41(3):254-255.

[2] 赵维中,戴俐明,方明,等.槲皮素在兔体内的药代动力学[J].中国药理学通报，1992.8(6)：452-455.

[3] 陈箐筠,干信.槐米中槲皮素的提取及其对中枢神经系统作用的研究进展[J].化学与生物工程,2007(3):11-13.

[4] 许俊博,吴怡,徐赞美,等.用RP-HPLC测定旋复花中旋复花内酯的含量[M].中国药学杂志,2003,38(1): 57-59.