芪蛭皱肺无糖颗粒对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型小气道重塑的影响

李金田， 梁 晶， 田永衍， 刘永琦， 李 娟， 任红艳， 张 骞， 张 毅

(甘肃中医学院，甘肃兰州730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限为特征的疾病，该病气流受限不完全可逆并呈进行性发展，同时因有害颗粒和气体的吸入而致肺部炎症［1］。本病属中医学咳嗽、喘证、哮证、肺胀等范畴［2，3］。COPD 由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题，受到世界各国的重视。目前的西医治疗虽能有效缓解症状和并发症，但仍没有药物能够有效控制COPD肺功能进行性下降。中医中药治疗COPD则有着十分广阔的前景，本研究通过对COPD模型大鼠肺组织病理切片MASSON染色的观察，采用放射免疫分析法对其支气管肺泡灌洗液(BALF)以及血清中层黏连蛋白(LN)和透明质酸(HA)的测定，以探讨芪蛭皱肺无糖颗粒对COPD小气道重塑的影响。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF级Wistar大鼠60只，♀♂各半，体重(200±20)g，由甘肃中医学院科研实验中心提供(动物质量合格证编号:SCXK(甘)2004-0006-0000005)。

1.2 饲养环境

动物室为SPF级，环境温度(23±3)℃，相对湿度30% ～40%，日光灯采光。清洁级饲料喂养，经高压消毒处理，均由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供。

1.3 受试药物

按体表面积折算率换算成大鼠等效剂量。

治疗药物:芪蛭皱肺无糖颗粒(由黄芪、水蛭、党参、丹参、麦冬、五味子、枳实等按一定比例组成，由甘肃中医学院药物制剂教研室提供);对照药物:固本咳喘片(台州南峰药业有限公司，生产批号:070504)。

1.4 主要试剂

兰州牌香烟(焦油量:12 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气一氧化碳量13 mg):甘肃·兰州卷烟厂;脂多糖(LPS)，10 mg/支，Sigma公司，生产批号:L-2880;乌拉坦:中国医药集团上海化学试剂公司;LN放免试剂盒:购于北京科美东雅生物技术有限公司，生产批号:20080825;HA放免试剂盒:购于北京科美东雅生物技术有限公司，生产批号:20080825。

1.5 主要仪器

AE200电子分析天平(梅特勒—托利多仪器上海有限公司);GC-9111型放射免疫γ计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司);KDC-2044低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);恒温水浴箱:上海医疗器械七厂;光学显微镜:德国。型号:CX31-32L02;石蜡切片机:德国。型号:RM2135;石蜡包埋机:日本。型号:TEC-VEM-J2;石蜡脱水机:日本。型号:VIP-5JR-J2。

2 方法

2.1 动物分组

实验动物适应性饲养3 d后，按随机数字表法分为:空白对照组、模型组、阳性药物对照组、芪蛭皱肺无糖颗粒小剂量组、芪蛭皱肺无糖颗粒中剂量组、芪蛭皱肺无糖颗粒大剂量组。每组10只，雌雄各半。

2.2 慢性阻塞性肺疾病模型制备

采用宋一平等［4］的方法并加以改良建立慢性阻塞性肺疾病模型大鼠。①在正常的室温环境中，第1、14天将大鼠麻醉后气管内滴入LPS:大鼠逐一称重，按5 mL/kg体重的比例，腹腔注射浓度为20%的乌拉坦溶液，大鼠麻醉后，将其固定于解剖台上，且采用头低位暴露声门，行气管插管后，快速注入溶于注射用生理盐水的浓度为1 mg/mL的LPS 0.2 mL，将大鼠直立，左右旋转，使LPS在两侧肺内均匀分布，后置于安静处，待其自然清醒后置笼内常规饲养。② 第2～28天(滴LPS当天不烟熏)给予大鼠每天一次香烟烟熏，每只大鼠一支烟，持续时间大约1/2 h。被动吸烟方法:将大鼠放入自制的容积为48 L的玻璃染毒箱(箱底两侧各有直径3 cm的进烟孔，箱盖中央有一直径3 cm的通气孔)内，香烟点燃后，进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧所产的水蒸气对大鼠的影响，在箱底放置适量硅胶干燥剂。

2.3 药物治疗

从第15天起，空白对照组、模型组给予中剂量颗粒辅料溶液3 mL灌胃;阳性药物对照组给予固本咳喘片溶液3 mL［相当于成药0.324 g/(kg·d)］灌胃治疗;芪蛭大剂量组［相当于生药2.16 g/(kg·d)］;芪蛭中剂量组［相当于生药1.08 g/(kg·d)］;芪蛭小剂量组［相当于生药0.54 g/(kg·d)］均给予芪蛭皱肺无糖颗粒溶液3 mL灌胃治疗。每日1次，连续灌胃28 d，所有动物均饲养42 d。实验药物的剂量换算:在对大鼠进行灌胃时，治疗药物和对照药物用量均按体表面积比率换算法(D2=D1×0.018×5)配制药液，临床等效剂量为实验的中剂量。

2.4 样本采集及制作

浓度为20%乌拉坦溶液，按5 mL/kg体重腹腔内注射麻醉大鼠，经股动脉采血，离心取血清约为1 mL，处死大鼠，分离肺脏，夹闭右肺，用3 mL生理盐水灌洗左侧肺脏，反复2次，回收量约为4 mL，离心，取上清液1 mL，同血清一起置于-20℃冰箱待测。用放免法检测BALF以及血清中LN和HA水平(按试剂盒说明书操作)。然后松开右肺，夹闭左侧肺脏，摘取右肺下叶，用4%多聚甲醛溶液固定一周，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片，MASSON染色，光镜下观察组织形态学改变。

3 统计学分析

结 果

1 病理组织学所见

肺组织切片经MASSON染色后显示(镜下观察):胶原纤维呈现淡蓝色，肌肉、胞浆呈现红色，胞核呈现蓝黑色。空白对照组:可见中、末支气管壁有较薄的胶原层，肺泡区有少量的胶原。模型组:支气管壁、肺间质、肺泡隔呈现胶原纤维明显增多，支气管周围胶原增生明显，并向肺间质延伸并且沉积。芪蛭小剂量组:中、末支气管壁、肺泡隔、肺间质呈现胶原纤维沉积，但与模型组相比为少，两组差异不明显。芪蛭中剂量组:支气管壁、肺泡隔、肺间质呈现胶原纤维沉积，但与模型组相比明显减少，两组差异较为显著。芪蛭大剂量组:支气管壁、肺泡隔、肺间质呈现胶原纤维与模型组相比为最少。阳性对照组:支气管壁、肺泡隔、肺间质呈现胶原纤维较模型组明显减少。

2 各组大鼠肺组织MASSON染色胶原平均面积的比较(见表1)

表1 各组大鼠肺组织MASSON染色胶原平均面积(±s)

表1 各组大鼠肺组织MASSON染色胶原平均面积(±s)

注:与空白对照组比较，▲▲P＜0.01;与 COPD模型组比较，●●P＜0.01;与阳性药物对照组比较，＆P＜0.05。

组别 例数/个 胶原平均面积/×104μm2空白对照组10 3.58±1.58模型组 8 21.14±6.33▲▲芪蛭小剂量组 8 10.41±3.90●●＆芪蛭中剂量组 9 5.11±2.65●●芪蛭大剂量组 9 5.57±3.50●●阳性对照组 9 6.00±3.28●●

结果显示:与空白对照组相比，模型组肺胶原平均面积显著升高，P＜0.01。与COPD模型组相比，芪蛭小、中、大剂量、阳性对照组肺胶原平均面积显著下降，P＜0.01。与阳性对照组相比，芪蛭小剂量组肺胶原平均面积明显下降，P＜0.05。

3 各组大鼠BALF中HA、LN含量的比较(见表2)

表2 各组大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

表2 各组大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

注:与空白对照组比较，▲▲P＜0.01;与COPD模型组比较，●P＜0.05，●●P ＜0.01;与阳性药物对照组比较，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

组别 例数/个 LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白对照组10 20.54±4.43 26.28±6.61模型组 8 33.86±5.90▲▲ 86.37±15.29▲▲芪蛭小剂量组 8 28.73±7.10 75.50±11.57芪蛭中剂量组 9 24.52±7.53●● 47.60±11.09●●＆＆芪蛭大剂量组 9 20.84±6.20●●＆ 38.58±4.52●●＆＆阳性对照组 9 27.19±4.35● 69.48±16.33●●

结果显示，模型组BALF中LN、HA含量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。芪蛭中、大剂量组BALF中LN、HA含量与模型组相比显著下降，P＜0.01。阳性对照组BALF中LN含量与模型组相比明显下降，P＜0.05。阳性对照组BALF中HA含量与模型组相比显著下降，P＜0.01。芪蛭大剂量组BALF中LN含量与阳性对照组相比明显下降，P＜0.05。芪蛭中、大剂量组BALF中HA含量与阳性对照组相比显著下降，P＜0.01。

4 各组大鼠血清中HA、LN含量的比较(见表3)

表3 各组大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

表3 各组大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

注:与空白对照组比较，▲▲P＜0.01;与COPD模型组比较，●P＜0.05，●●P ＜0.01;与阳性药物对照组比较，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

组别 例数 LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白对照组10 25.76±3.87 293.48±60.89模型组 8 41.06±8.79▲▲ 483.05±64.24▲▲芪蛭小剂量组 8 34.08±5.63● 415.47±93.66＆＆芪蛭中剂量组 9 31.39±5.71●● 389.57±89.21●＆芪蛭大剂量组 9 28.36±6.44●● 320.38±48.29●●阳性对照组 9 34.04±7.71● 312.25±68.18●●

结果显示，模型组血清中LN、HA含量与空白对照组相比显著升高，P＜0.01。芪蛭小剂量组血清中LN含量与模型组相比明显下降，P＜0.05。芪蛭中剂量组血清中LN含量与模型组相比显著下降，P＜0.01，HA含量与模型组相比明显下降，P＜0.05。芪蛭大剂量组血清中LN、HA含量与模型组相比显著下降，P＜0.01。阳性对照组血清中LN含量与模型组相比明显下降，P＜0.05，HA含量与模型组相比显著下降，P＜0.01。芪蛭小剂量组血清中HA含量与阳性对照组相比显著升高，P＜0.01。芪蛭中剂量组血清中HA含量与阳性对照组相比明显升高，P ＜0.05。

讨 论

在COPD发生、发展的过程中，导致肺组织内部小气道重塑的原因是多方面的，其中肺内的细胞外基质(ECM)主要成分胶原蛋白、蛋白多糖及黏连糖蛋白是支气管肺组织的炎症、损伤、修复、重塑的重要原因，是COPD不断发展的病理基础。

胶原蛋白是ECM的主要成分，肺脏的胶原成分是维持肺脏结构的完整性、间隔性和具有容积功能的基础。胶原分布于肺结缔组织网的各个部位。I型和Ⅲ型胶原是肺间质的主要纤维成分，因此胶原在肺脏沉积与降解速度之间的平衡状态，对于维持肺脏的正常结构与功能具有十分关键性的作用。通过对病理观察，可以明显看到芪蛭大剂量组胶原减少最为显著，中剂量组胶原平均面积为最少。

LN是存在于ECM中的一种糖蛋白，且与胶原一同构成基底膜骨架，对ECM的代谢起着极为重要的调节作用。研究表明，LN具有刺激细胞迁移、黏附、分化和生长等丰富的生物学活性，在肺组织纤维化病变进展中具有非常重要的作用［5］;LN的增多可以使炎性细胞数量增多，同时积聚于基底膜，导致肺组织纤维化［6］;LN的增多还提示上皮细胞出现损伤、破坏，不断有新的细胞生长，增生和修复，导致上皮增厚［7］。本实验结果显示芪蛭大、中剂量组大鼠BALF以及血清中LN含量同模型组相比显著降低，其中在BALF中芪蛭大剂量组与阳性药物组相比有明显差异，且作用要优于中剂量组和阳性组。说明大剂量芪蛭皱肺无糖颗粒在对COPD大鼠肺组织LN的代谢、肺脏纤维化和小气道的重塑方面，发挥着重要的作用。

HA是ECM中糖胺聚糖的主要成分。已经有研究指出 HA与很多肺脏疾患的发生有关［5］，是COPD敏感的炎症标志物［8］，还参与胶原纤维的合成作用，能使静止的纤维细胞活化，形成具有合成和分泌胶原蛋白功能的成纤维细胞。而肺成纤维细胞的活化、增殖以及通过释放介质使肺内ECM产生增多，因此，HA在肺纤维化发病机制中起决定性作用。实验结果显示芪蛭中剂量组、大剂量组、阳性组大鼠BALF中HA含量比模型组显著降低;芪蛭中、大剂量组同阳性药物组相比有显著性差异;其中大剂量组的作用要优于中剂量组。这一结果说明大剂量芪蛭皱肺无糖颗粒可明显干预COPD大鼠肺脏HA的代谢，进而影响COPD肺组织纤维化和小气道的重塑。

COPD的病因不外乎外感与内伤。肺系病易虚易实，结合本病的特点，可以概括为肺脾肾虚、痰瘀阻肺。肺、脾、肾三脏之虚是COPD反复发作的重要内因，血瘀贯穿慢性阻塞性肺疾病始终，是其重要的病理改变。芪蛭皱肺无糖颗粒，方中黄芪为补肺气要药，补气以助血行;水蛭破血逐瘀，消散肺中瘀血，共为君药;党参健脾益肺，既助黄芪补肺气，又擅补脾气而培土生金;丹参既补血又活血，使补而不滞，活而不伤，均为臣药。五味子敛肺滋肾，麦冬以养阴润肺，既收耗散之肺气，又润虚损之肺阴;枳实开肺脾之气而消痞胀，化痰饮，俱为佐药。诸药合用，标本兼治，虚实共调，有益气培元，化痰活血，瘪皱肺胀之功效。本实验结果显示，芪蛭皱肺无糖颗粒可以缓解肺内细支气管、终末细支气管管腔及周围胶原纤维的浸润和分泌物阻塞，恢复纤毛黏连、倒伏、脱落，且芪蛭大剂量组大鼠BALF以及血清中HA以及LN含量较模型组明显降低，芪蛭中剂量组胶原平均面积最小为各组中最小。结合其病理特点，说明芪蛭皱肺无糖颗粒通过补气活血通络的方法，在COPD进行性加重过程中，对小气道重塑具有重要的干预作用。

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［8］郭庭杰.COPD患者肺内的透明质酸水平增高与肺功能和局部炎症的相关性［J］.国外医学内科学分册，2006，33(2):92.